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丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）是常见的一种植物病原细菌，也是一类冰核活性细菌，而其主要的致病因子就是该菌产生的一种分泌性蛋白质，即冰晶核蛋白（Ice nucleation protein，INP）。本研究中以实验室自行分离的一株具有高冰核活性的菌株丁香假单胞菌MB03的冰核基因inaQ为对象，以绿色荧光蛋白（Green fluorescence protein, GFP）基因为报告基因，对inaQ基因启动子的转录活性及其与上游转录因子的结合作用进行了研究。结果如下： 1.冰晶核蛋白基因inaQ启动子活性的研究 本室前期研究工作中已通过原位杂交的方法克隆得到冰核蛋白基因inaQ（GenBank登录号：EU360731）。通过设计系列引物构建了3个携带不同启动子删除片段连有gfp融合基因的质粒pInaQ10GFP、pInaQ-10GFP和pInaQAGFP。连同实验室前期构建的含有启动子全长的质粒pInaQ522GFP，以及另两个启动子元件截短的质粒pInaQ297GFP和pInaQ111GFP，分别转化得到重组菌MB522，MB297， MB111，MB10，MB-10和MBA。荧光显微镜镜检、SDS-PAGE和Western Blot等实验表明了重组菌能够成功表达GFP，重组菌构建成功。GFP特异性荧光强度测定结果表明，带有GFP全长启动子的重组菌MB522、截短部分启动子的重组菌MB297、删除A box与起始位点之间的间隔区保留10bp的重组菌MB10和删除B box保留A box的重组菌MBA都具有较高的荧光活性值，分别为473.177、438.471、459.033和314.363，而截短了启动子的重组菌MB111和删除A box直到起始位点-10bp的重组菌MB-10的荧光活性值为55.975和50.213，结果说明了保留了A box与B box的启动子活性较高，而删除了部分片段的启动子的活性相对比较低；对重组菌MB522、MB297、MB10和MBA进行化学物质4-羟基-3-硝基苯乙酸诱导，荧光活性值检测结果表明化学物质对启动子的活性影响并不大，化学物质的诱导刺激部位及其作用因子并不明确；对构建好的的质粒pInaQ10GFP、pInaQ-10GFP、pInaQAGFP、pInaQ522GFP、pInaQ297GFP和pInaQ111GFP进行了不同宿主菌的转化培养，结果表明启动子的活性与宿主菌相关。 2.冰晶核蛋白基因inaQ启动子上游转录因子的研究 通过基因组序列的比对，在冰晶核蛋白基因启动子上游找到了GntR家族转录因子的一个蛋白质，其编码基因命名为GntR，序列分析结果表明，所扩增的基因GntR编码253个氨基酸序列，理论分子量为28.6kDa，等电点为8.13。构建了带有GntR基因的重组质粒pMB437，转入大肠杆菌受体菌Top10中进行IPTG诱导表达，获得了与理论分子量大小相符的表达产物。对得到的蛋白进行His标签亲和纯化，将纯化的GntR蛋白进行了聚丙烯酰胺凝胶阻滞实验（EMSA），初步验证了冰晶核蛋白基因inaQ启动子可以与GntR蛋白的结合。