家蚕BmMLs蛋白家族的功能特性及与信息素结合初探

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家蚕作为重要的经济动物,从化学通讯、气味识别到蜕皮激素的合成代谢过程均有脂质物质参与。识别脂质物质的脂质结合蛋白超家族广泛分布于植物、动物以及真菌等生物,通过与特定脂质相互作用介导不同的生物学功能。ML家族蛋白分为3类:髓样分化蛋白-2(Myeloid differentiation protein-2,MD-2)家族、C型尼曼匹克病蛋白2(Nieman-pick type C2,NPC2)家族和ML相关脂质识别蛋白(MD-2 related lipid recognition,ML)家族。在脊椎动物中,MD-2蛋白主要识别脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)辅助TLR4引发下游的免疫反应;NPC2蛋白主要参与胆固醇转运代谢。家蚕基因组中存在8个BmMLs蛋白序列,在家蚕基因组数据库中分别命名为Bm NPC2a、Bm NPC2b、Bm Esr16、Bm ML-1、Bm ML-2、Bm ML-3、Bm ML-4、Bm ML-5。为了进一步研究BmMLs家族成员的生物学功能,本研究通过生物信息学分析、荧光定量RT-qPCR检测、ELISA检测和RNAi实验初步探索了BmMLs在家蚕中的组织特异性表达特点、与脂类物质的结合及参与触角信息素识别的功能。获得的主要研究结果如下:(1)结合家蚕基因组数据库对BmMLs进行生物信息学分析,发现Bm Esr16和Bm ML-1与哺乳动物NPC2有较近的亲缘性;结构预测发现8个BmMLs蛋白皆具有7-8个β-折叠,β-折叠片层直接形成疏水性结合腔,预测具有脂类物质结合能力。(2)通过RT-qPCR检测BmMLs在家蚕中的组织特异性表达特点,发现Bm NPC2a在每个组织中表达量都很高。Bm NPC2b、Bm Esr16、Bm ML-1、Bm ML-2在不同组织中有不同表达;Bm ML-3、Bm ML-4、Bm ML-5的转录表达活性很低。8条BmMLs基因家族成员在家蚕成虫触角中转录活性较高,Bm ML-3的转录表达有雌性差异。(3)PCR扩增获得BmMLs基因全长,克隆至真核表达载体上,转染S2细胞进行真核表达,并通过Ni-NTA亲和层析进行纯化。将纯化的蛋白与脂类物质进行ELISA实验,发现Bm NPC2a、Bm NPC2b、Bm Esr16和Bm ML-1蛋白与LPS、20E、Cholesterol都有一定的结合能力,其中Bm NPC2a表现高结合能力。(4)在家蚕5龄3天时注射Cholesterol、20E和LPS,通过RT-qPCR检测BmMLs的转录表达,发现Cholesterol对所有的BmMLs都诱导上调,而Bm ML-1没有被20E、LPS诱导上调,其他基因都有一定的上调。(5)通过RNAi技术干扰家蚕雄性成虫的Bm NPC2a、Bm NPC2b、Bm ML-1和Bm ML-3基因后,Bm NPC2a和Bm ML-3干扰组出现交配异常现象,暗示Bm NPC2a和Bm ML-3可能参与了家蚕成虫交配时信息素的识别。本研究结果表明,8个BmMLs在家蚕中有组织特异性表达,根据其与脂类物质的结合模拟推测它们在家蚕中发挥不同的生物学功能。RNAi实验暗示Bm NPC2a和Bm ML-3可能参与成虫信息素的结合,具体的分子生物学机制还需要进一步研究来阐明。
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