第一部分 全基因组测序NIPT检出染色体异常的流行病学研究研究背景:自2013年后无创产前遗传学检测(NIPT)快速商业化,并在实际上部分取代了常规的侵入性产前诊断及核型分析,而不仅仅用于21三体筛查。虽然目前普遍使用的商业化低通量全基因组芯片,其理论分辨率足够检测5Mb左右的CNV,但受测序深度及母血中cff-DNA浓度影响,以及胎盘嵌合体等干扰测序因素,可能造成假阳性/假阴性。为了解当前全基因组测序NIPT在临床应用中的实际检出的染色体异常比例,以及异常种类的分布情况,是否同细胞遗传学核型检测的结果流行病分布一致,故开展流行病学调查。研究目的:比较NIPT与常规细胞学核型各自检出的染色体异常的检出率的差别,以及各种异常在基因组中的分布情况。研究对象和方法:(1)研究分组:以接受NIPT检查人群为观察组,同期进行羊水穿刺核型分析的孕妇为对照组,采用现况调查的方式,收集病人基本信息,包括接受遗传学检查的指证(风险值),比较两组染色体异常检出率的差异,结果根据风险值及年龄进行标准化校正偏倚并亚组分析。(2)NIPT人群的选择:回顾性选择2013年6月-2018年6月期间于台州市产前诊断中心进行NIPT检查的单胎孕妇。共获得22170例NIPT检查样本资料。其中年龄高风险(≥35岁)7550人,血清学筛查风险(风险值≤000)10011人。(3)对照组病人的选择:回顾性选择2013年6月-2018年6月期间于台州市产前诊断中心首次进行羊水核型分析的单胎孕妇。因NIPT结果阳性而进行介入性产前诊断者不重复计入对照组统计。共获得20168例核型分析样本资料。其中年龄高风险(≥35岁)10060人,血清学筛查风险(风险值≤000)7963 人。(4)检测方法:研究期间NIPT均采用相同半导体测序平台(Ion Proton测序仪,Life Technologies),测序深度为400X,羊水细胞培养12天,进行350显带核型分析。(5)阳性结果的判定:NIPT阳性结果以介入穿刺或引产后胎儿核型确诊,假阳性结果不计入检出率统计。非整倍体结果以细胞学核型分析或CMA结果为金标准,而结构微缺失/重复)以CMA结果为金标准。仅计算真阳性结果的检出率。(6)研究主要结局:两组标准化的染色体异常检出率,染色体异常分为非整倍体(数目异常)和结构不平衡。标准化方法:分别以年龄和筛查风险值作为分层变量,分别计算高龄与血清学筛查风险人群各层的检出率。研究结果:(1)染色体异常的标准化检出率通过标准化校正,高龄孕妇的NIPT与细胞核型的非整倍体检出率分别为1.49%和1.54%(χ2=0.319,p=0.572,表1-3-2-1),染色体结构不平衡检出率为0.15%和0.1%(χ2=0.276 p=0.131,表1-3-3-1);高风险孕妇的非整倍体检出率分别为1.2%%和1.3%(χ2=0.900,p=0.343,表1-3-2-2),染色体结构不平衡检出率为 0.14%和 0.18%(χ2=0.861,p=0.353,表 1-3-3-2)。(2)染色体异常的分布两组染色体异常在基因组中的分布均无统计差别(图1-3-3-3),非整倍体的发生率与年龄及筛查风险均呈线性相关(高龄孕妇中非整倍体发生率与核型β=0.785,p=0.007,与 NIPT β=0.862,p=0.001,图 1-3-2-1;高风险孕妇中非整倍体发生率核型 β=-0.415 p=0.013,与 NIPT β=-0.455,p=0.038,图 1-3-2-2),而染色体结构不平衡与风险因素无统计关联(图1-3-3-1,图1-3-3-2)。研究结论:(1)NIPT诊断染色体异常(非整倍体与结构不平衡)的检出率及异常的分布与标准细胞学核型相比无统计差别,NIPT可以达到与细胞核型相同的检出能力。(2)NIPT及细胞学核型检出的非整倍体分布均与年龄及筛查风险相关,而检出的结构不平衡与风险程度无关,提示非整倍体与结构异常胚胎学来源不同。第二部分 全基因组测序NIPT的前瞻性效益研究研究背景:本研究第一部分的病例对照研究结果提示,经过标准化校正,NIPT在同一年龄或筛查风险值时,其对的染色体异常(非整倍体与结构不平衡)的检出率相同,同时检出的异常染色体的分布与常规细胞学核型相比也无统计差别。可以推断在相同的人群中,两种遗传学检测方法诊断的真阳性人数与异常种类相同。当然回顾性研究无法得到全部假阴性的数据,因此亦不能对其诊断的真实性与诊断效益进行评估。另外无论NIPT亦或核型分析,其检测分辨率(检出微缺失、微重复的能力)均无法进行评价。因此我们以CMA结果为金标准开展诊断试验,来验证回顾性研究中NIPT与核型分析之检测效益是否相同,同时根据ROC曲线,计算两者诊断染色体异常片段的大小(分辨率)的界值。研究目的:本研究目的为前瞻性比较NIPT,细胞学核型用于检测染色体异常的诊断效益以及诊断分辨率。研究对象与方法:(1)研究方式及分组:对需要羊水穿刺进行常规培养和CMA检测的孕妇,同时进行NIPT检查,采用自身对照的方式,以CMA结果为金标准,进行以NIPT为观察组、核型分析为对照组的诊断试验。(2)病例入组标准:病例招募时间自2016年1月至2017年7月。招募地点为台州市产前诊断中心。入组标准为:大于孕16周单胎,需要羊水穿刺并同时行CMA和细胞学核型分析孕妇。羊水穿刺指证包括:超声结构异常、高龄以及血清学筛查高风险。(3)病例排除标准:双胎或多胎,异体输血史,或感染、先兆流产等羊穿手术禁忌症病人。最终802人获得全部3组检测数据。(4)检测方法:NIPT采用半导体测序平台(Ion Proton测序仪,Life Technologies),测序深度为400X。羊水细胞培养12天,进行350显带核型分析。CMA检测使用Affymetrix CytoScan 750K芯片,报告分辨率为0.1 Mb。(5)结果解读:CNVs依据染色体区域、片段大小、包含基因以及遗传方式分类为致病、疑似致病、不明确意义,以及良性。遗传自正常表型父母的CNVs被认为良性,新发突变归类为疑似致病。(6)研究主要结局:本研究仅统计非整倍体及结构缺失/重复的诊断真实性及效益,平衡结构异常包括易位、倒位以及杂合性丢失不计入结局统计。真实性指标包括灵敏度sensitivity(Sen),特异性specificity(Spe),效益指标包括阳性预测值positive predictive value(PPV)和阴性预测值negative predictive value(NPV)。计算公式如下:Sen=NIPT或核型真阳性数/CMA总阳性数、Spe=NIPT或核型真阴性数/CMA总阴性数、PPV=真阳性数/NIPT或核型阳性数、NPV=真阳性数/NIPT或核型阴性数(7)统计学方法:数据处理及统计计算采用Microsoft Excel及SPSS 22软件。本研究依照临床处理流程,仅致病、疑似致病作为阳性结果,良性CNVs归入阴性结果。以两种方法诊断不同分辨率时的灵敏度为纵轴,1-特异度为横轴,绘制ROC工作曲线,并计算分辨率界值。样本量计算根据预期NIPT检测>1M CNVs的准确性为80%而特异性为90%,细胞学核型分析的准确性与特异性分别为79.6%a和99%,据此计算有效的阳性样本量为61(β=0.1,双尾 p<0.05)。研究结果:(1)研究样本及一般特征CMA共确诊69例染色体异常,27例为非整倍体,42例结构不平衡,其中13例为良性或遗传自表型常父母。27例非整倍体中,核型分析检出全部非整倍体,NIPT漏诊1例嵌合型性染色体异常:45,X[48]/46,XX[62]。29例CMA确诊的病理性CNVs中,NIPT检出9例,细胞核型检出7例(表2-3-1-4)。(2)NIPT与细胞核型分析的检测染色体异常的诊断效率比较以CMA为金标准,NIPT与细胞核型检测非整倍体的诊断效率(灵敏度、特异度、阳性与阴性预测值)无统计区别。两者检测染色体结构不平衡的诊断效率亦无统计区别(表2-3-2-1,p>0.05)。(3)NIPT与细胞核型分析的检测染色体异常的诊断分辨率比较对于长度为5-20Mb的CNVs,NIPT比核型有略高的诊断敏感性(表2-3-2-2,p<0.05)。ROC曲线(图2-3-3-1)显示,NIPT与核型分析曲线下面积无统计差别(AUC分别为0.786和0.81,Z=0.314,p=0.363),两者分辨率的诊断界值分别为5.4Mb和13.2Mb,以上均提示NIPT比核型有略高的分辨率。研究结论:(1)全基因组测序NIPT与常规的350条带核型分析在检测胎儿染色体异常(非整倍体与缺失重复)的诊断效益与真实性相似。(2)对于染色体结构不平衡的检测时,NIPT可能有更高的分辨率。第三部分 基于全基因组测序的无创植入前筛查的探索性研究研究背景:目前临床采用的PGS技术,无论是卵裂球或囊胚,都是通过活检采集完成。这种采集样本方式对配子或胚胎而言是有创的操作,可以造成一定的胚胎损伤及浪费。同时活检操作时间长,增加胚胎离开培养箱时间,而且需要复杂的技能及设备,不适合推广使用。而NIPT的临床应用给PGS带来了全新的突破:NI-PGT。废弃的培养液、囊胚冻存前释放的囊胚腔液都包含有cfDNA并可进行全基因组扩增并检测,如可利用该废弃液体进行有效的无创的染色体筛查,将给植入前筛查与诊断技术带来及其重大的变革。当然培养液cfDNA为一种包括颗粒细胞、精子的混合源性基因组,而囊胚腔内cfDNA来源于异常细胞崩解,因此此类cfDNA与囊胚细胞在染色体水平上的一致性是否足够用于检测仍有待明确。为了探讨NIPT在胚胎植入前的扩展应用,本研究尝试对胚胎培养液以及囊胚腔液中的cfDNA进行分析,并比较两者与囊胚细胞核型的一致性,进一步探索NIPGT的技术方法。研究目的:(1)确定培养液、囊胚腔液DNA含量及是否足够用于WGS扩增。(2)确定培养液、囊胚腔液基因组与囊胚细胞基因组的一致性,探讨无创植入前筛查技术的可行性。材料与方法:(1)样本采集:实验样本采用体外受精后的D3剩余4-5级废弃胚胎,持续培养至囊胚形成。囊胚腔液采用显微操作法抽取作为观察组1。对于ICSI受精的胚胎同时采集4-5天的培养液作为观察组2。研究采用自身对照,以显微操作器提取囊胚细胞作为对照组。。(2)全基因组扩增及测序。三组样本使用相同的方法进行全基因组扩增,扩增采用GenomePlex单细胞全基因组扩增试剂盒(Sigma)。测序采用半导体测序平台(Ion Proton测序仪,Life Technologies),测序深度同NIPT。研究结果:(1)样本获取情况共获得14个囊胚,其中7个ICSI受精囊胚同时检测培养液和囊胚腔液,其中1例囊胚腔液在操作过程中丢失。另外7例常规IVF受精囊胚,未进行培养液基因组扩增,仅进行囊胚腔液检测。(2)样本检测结果其中14个囊胚细胞有1个扩增失败(93%),扩增囊胚腔液样本13个,达到上机要求10个(76.9%),扩增培养液样本7个,达到上机要求6个(85.7%)。对11组上机测序结果提示其中8个正常核型胚胎,非整倍体1个,其余2个为结构不平衡。囊胚腔液与囊胚细胞非整倍体符合率90%,培养液与囊胚细胞总符合率为66%。囊胚腔液全基因组扩增后诊断非整倍体灵敏度100%,特异性为75%。培养液全基因组扩增后特异性为80%。对于5M以下缺失重复,两种方法均不能成功检出。研究结论:(1)囊胚腔液与培养液中均包含全基因组信息,其DNA含量达到检测水平。(2)两种成分均可进行染色体数目异常的检测,不适于检测结构不平衡。