研究背景:近年来,随着经济、社会的不断发展,人们生活方式的改变以及人口老龄化问题的日益突出,骨质疏松症（osteoporosis,OP）和肥胖的患病率均日趋攀升,成为威胁全球人类健康的公共卫生难题。OP和肥胖均为代谢性紊乱疾病,且研究发现两者存在密切的相关性。既往有观点认为,肥胖导致的体重增加能够防止骨质丢失和OP的发生,对骨形成具有促进作用。然而,越来越多的动物实验证实,高脂摄入能导致骨强度降低,骨小梁微结构损害,临床研究也发现过多的脂肪量是人类骨量丢失的重要危险因素,肥胖患者发生OP相关性骨折的风险显著增加。脂肪组织目前被认为不仅是储备能量的器官,同时也是重要的内分泌器官,能分泌多种脂肪因子,如脂联素（adiponectin）、瘦素（leptin）和抵抗素（resistin）等,参与机体的能量代谢和免疫炎症反应。近来研究发现,上述脂肪细胞因子不仅参与了糖、脂代谢、胰岛素敏感性、心血管功能等生理过程的调节,而且对骨代谢的调节也具有非常重要的作用。体外细胞实验研究发现adiponectin 能促进骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cell,BMSC）向成骨细胞（osteoblasts,OB）分化,促进OB的增殖及分化,抑制破骨细胞生成;Leptin能促进人BMSC的成骨分化,刺激人OB的增殖、分化与矿化,抑制破骨细胞功能,减少破骨细胞形成。动物实验证实颈内静脉注射表达adiponectin的腺病毒后骨骨小梁量增加,皮下注射leptin可以预防去卵巢大鼠的骨量丢失,促进ob/ob小鼠骨形成,腹腔注射leptin有利于大鼠骨折的愈合。由此可见,脂肪细胞因子在调节骨代谢的过程中发挥重要的作用,脂肪细胞因子的异常分泌也可能是肥胖患者骨折风险增加的一个重要原因,因此研究脂肪细胞因子与骨代谢的相关性及其作用机制可为OP的防治提供新的途径。内脏脂肪组织特异性丝氨酸蛋白酶抑制剂（Visceral adipose tissue derived serine protease inhibitor,vaspin）是新发现的一种脂肪细胞因子,属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的一员,最早于一种2型糖尿病大鼠（Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty,OLETF Rat）的内脏白色脂肪组织中发现,已有研究证实vaspin不仅可以发挥抑制炎症反应、增加胰岛素敏感性及改善糖耐量水平等作用,而且与心、脑血管事件的发生也存在密切的相关性。中枢输注及外周注射vaspin均可改善高脂诱导的胰岛素抵抗SD大鼠的肝糖代谢及胰岛素敏感性,腹腔注射vaspin不仅可以通过抑制外周血管重塑发挥降压的作用,还可以抑制肺动脉高压进展。而近来研究发现vaspin与骨代谢也密切相关。体外实验研究发现vaspin干预处理能抑制破骨细胞生成,减少人OB的凋亡,调控小鼠成骨前体细胞MC3T3-E1的成骨分化。近来有临床资料显示,绝经后女性血清vaspin水平与股骨颈骨密度（bone mineral density,BMD）呈显著正相关,这一现象提示vaspin可能作为一种代偿性的因子在骨代谢中起到保护作用。然而,目前应用vaspin干预骨代谢的研究均为体外细胞实验,而体内注射vaspin是否也像adiponectin及leptin一样对SD大鼠骨代谢产生影响,目前尚未有研究证实。与骨代谢相关的细胞信号通路也是近来的研究热点,可为骨代谢相关疾病的防治提供新的治疗靶点。最近的研究表明,vaspin通过多种细胞信号通路参与了对骨代谢的调节,如RANK/RANKL通路、MAPK/ERK及Wnt/β-catenin信号通路等。Smad2/3-Runx2信号通路是参与骨形成的重要信号通路,也是细胞信号通路与骨代谢相关性中的研究热点,然而目前有关vaspin是否能通过Smad2/3-Runx2信号通路发挥对OB的调节作用尚未有报道。而我们在预实验中应用重组vaspin蛋白干预OB时,RT-PCR结果显示OB中Smad2/3和runt相关转录因子 2（runt-related transcription factor 2,Runx2）的 mRNA 表达水平显著增加,提示vaspin可能通过Smad2/3-Runx2信号通路调控了 OB的分化,进而对骨代谢产生影响。我们课题组前期的研究已证实,高脂喂养可导致SD大鼠骨量的丢失,本课题旨在研究vaspin对骨代谢的影响及潜在作用机制,观察vaspin对高脂诱导的SD大鼠骨量丢失是否有拮抗作用,体外细胞实验应用不同浓度的重组vaspin蛋白干预大鼠OB,观察vaspin是否可促进OB的分化并初步探讨可能的机制,从而为OP的防治提供更多的理论依据和新的治疗方向。目的:1、观察高脂饮食和vaspin干预对雄性SD大鼠体重、摄食量、全身代谢状况、骨生物力学、骨微结构、骨代谢标志物及成骨相关基因表达水平的影响。2、提取SD大鼠原代OB,观察不同浓度的vaspin对OB增殖的影响,确定最佳实验浓度。3、应用不同浓度的vaspin干预OB,探讨vaspin是否具有促进OB成骨分化的作用及可能的机制。研究方法:1、动物处理:本研究选用4周龄的雄性SD大鼠40只,适应性喂养1周后,将40只大鼠随机分为普食喂养组和高脂喂养组,分别给予普食或高脂喂养12周后,再将普食喂养组随机分为普食组（normal diet,ND）和普食+vaspin干预组（normal diet and vaspin treatment,ND+vaspin）,高脂喂养组随机分为高脂组（high-fat diet,HFD）和高脂+vaspin 干预组（high-fat diet and vaspin treatment,HFD+vaspin）,每组各10只,继续分别给予普食或高脂喂养,同时vaspin干预组大鼠给予vaspin1μg/kg.d腹腔注射,对照组给予等量生理盐水腹腔注射,干预10周,每周记录大鼠的进食量和体重变化。2、代谢评估:大鼠的机体代谢情况应用生物代谢笼分析,包括:耗氧量（volume of oxygen consumed,VO2）、二氧化碳生成量（production of carbon dioxide,VCO2）、呼吸交换率（espiratory exchange ratio,RER）、产热量（heat production,H）和物理活动度（physical activity）。3、实验结束后,麻醉处死大鼠后取血,血清钙（calcium,Ca）,无机磷（phosphorus,P）,总胆固醇（total cholesterol,TC）、甘油三酯（triglyceride,TG）、空腹血糖（fasting plasma glucose）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol,HDL）和低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol,LDL）浓度用全自动生化分析仪测定,应用ELISA试剂盒检测血清 1 型胶原 C 末端肽（C-Telopeptide of type 1 collagen,CTX）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）及 1 型胶原 N 端前肽（procollagen I N-terminal peptide,P1NP）水平。4、取右侧胫骨进行骨生物力学检测,观察骨强度变化。取左侧胫骨进行microCT检查,观察骨微结构变化。RT-PCR法检测SD大鼠胫骨Runx2和成骨细胞特异性转录因子（Osterix,OSX）的mRNA表达水平。5、酶消化法、差速贴壁法提取原代OB,ALP染色和HE染色鉴定细胞是否为OB。CCK8法观察不同浓度的vaspin对OB增殖的影响。6、ALP活性测定试剂盒检测不同浓度的vaspin对OB的ALP活性的影响;RT-PCR法检测不同浓度的vaspin对成骨早期标记基因Ⅰ型胶原（alphal Type ⅠCollagen,Colla1）、Runx2、OSX 表达变化的影响。7、采用Western Blotting检测不同浓度的vaspin对β-连环蛋白（catenin beta1,β-catenin）、Runx2、OSX、Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3 以及内参蛋白GAPDH表达水平变化的影响。8、应用免疫荧光技术检测不同浓度的vaspin对Runx2表达的影响。结果:1、Vaspin干预治疗10周可显著降低高脂饮食导致的体重增加,而对大鼠的摄食量没有影响。给予高脂饮食喂养12周后,高脂喂养组较普食喂养组大鼠体重显著增加,差异有统计学意义（P<0.05）。然而,虽继续给予高脂喂养但经过vaspin干预治疗10周后,与HFD组比较,HFD+vaspin组体重显著下降（P<0.05）。而ND组与ND+vaspin组、HFD+vaspin组三组间相比大鼠体重没有统计学差异（P>0.05）。另外我们发现,腹腔注射vaspin 1μg/kg.d,无论是ND+vaspin组与ND组相比,还是HFD+vaspin组与HFD组相比,大鼠的摄食量均没有统计学差异（P>0.05）。上述结果表明采用vaspin干预治疗10周后可明显降低高脂饮食诱导的大鼠体重增加,而对其摄食量没有产生显著的影响。2、Vaspin干预治疗可显著改善高脂饮食导致的全身低代谢状况。经过vaspin或生理盐水干预治疗10周后,与ND组相比,HFD组VO2、VCO2、RER、H和物理活动量及其对应的曲线下面积（AUC）均明显下降（P<0.05）。而HFD+vaspin组VO2、VCO2、RER、H和物理活动量及其对应的AUC均较HFD组明显增加（P<0.05）,与ND组相比无统计学差异（P>0.05）。上述实验结果提示,高脂喂养可导致大鼠全身新陈代谢指标整体显著降低,而vaspin干预治疗10周能显著改善HFD诱导的全身低代谢状态。3、HFD显著降低血清ALP水平和P1NP水平,升高血清CTX和血糖水平,而vaspin干预治疗可逆转上述血清学指标的改变。与ND组、ND+vaspin组及HFD+vaspin组相比较,HFD组血清ALP水平及P1NP水平明显下降（P<0.05）,血清CTX显著升高（P<0.05）。而与HFD组相比,HFD+vaspin组血清ALP水平及P1NP水平显著升高（P<0.05）,血清CTX显著下降（P<0.05）。上述实验结果证实,高脂饮食可降低血清ALP及P1NP水平,升高血清CTX水平,而vaspin干预治疗能逆转HFD对上述骨代谢标志物的影响。4、Vaspin干预治疗改善高脂饮食诱导的雄性SD大鼠骨生物力学损害。与ND组、ND+vaspin组及HFD+vaspin组相比,HFD组最大负荷（Maximum load）、最大断裂负荷（Maximum fracture load）、韧性（Stiffness）、能量吸收（Energy absorption）、弹性模量（Elastic modulus）、最大拉伸强度（Maximum strength）均显著降低（P<0.05）。而 ND+vaspin 组、HFD+vaspin组与ND组比较,组间无统计学差异（P>0.05）。上述结果提示,高脂饮食可导致骨强度明显降低,而vaspin干预治疗可显著改善上述骨生物力学参数。5、Vaspin干预治疗改善高脂饮食对雄性SD大鼠骨小梁微结构的破坏。与ND组相比,HFD组骨小梁相关指标发生明显的变化,包括骨小梁体积骨密度（trabecular volume bone mineral density,Tb.vBMD）、骨小梁体积与骨总体积比（trabecular bone volume/total volume,Tb.BV/TV）、骨小梁数目（trabecular number,Tb.N）、骨小梁厚度（trabecular thickness,Tb.Th）显著降低（P<0.05）,而结构模型指数（structure model index,SMI）和骨小梁分离度（trabecular separation,Tb.Sp）显著升高（P<0.05）。10 周的 vaspin 干预治疗可使 Tb.vBMD、Tb.N、Tb.Th、Tb.BV/TV 明显升高（P<0.05）,Tb.Sp 和SMI显著下降（P<0.05）,这些结果提示vaspin干预治疗可改善高脂饮食诱导的骨量减少和骨微结构破坏。6、Vaspin干预治疗显著上调SD大鼠成骨相关基因Runx2和OSX的mRNA表达水平。与ND组相比,HFD组的Runx2和OSX的mRNA表达水平显著下降（P<0.05）;而 HFD+vaspin 组与 ND 组相比,无论是 Runx2 mRNA 还是 OSX mRNA的表达水平,两组之间均无统计学差异（P>0.05）;另外,ND+vaspin组与ND组相比,Runx2 mRNA和OSX mRNA的表达水平均显著上调（P<0.05）。上述结果提示,vaspin可能促进体内骨形成。7、不同浓度的vaspin对OB的增殖无显著影响。CCK8 结果显示,不同浓度的 vaspin（10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL）分别处理OB 12小时、24小时、48小时和72小时后,与对照组相比,vaspin浓度即使达到100 ng/mL对OB的活性仍没有显著的抑制作用（P>0.05）,提示100 ng/ml浓度以内的vaspin对OB无明显细胞毒性。8、Vaspin可以显著提高OB的ALP活性,对成骨相关基因Colla1、Runx2、OSX具有明显上调作用,且具有一定的剂置依赖性。细胞实验结果显示,应用vaspin干预细胞48小时后,与对照组及10 ng/mL的vaspin组相比,50 ng/mL、100 ng/mL的vaspin可以显著提高OB的ALP活性,对成骨相关基因Runx2、OSX、Colla1的表达均具有明显促进作用,且100 ng/mL的vaspin组较50 ng/mL的vaspin组具有更加明显的促进作用。而应用50 ng/mL的vaspin分别处理OB12小时、24小时和48小时后,我们发现与空白对照组相比,无论是vaspin处理12小时组、24小时组还是48小时组,Runx2、OSX、Colla1的mRNA表达水平均被显著上调（P<0.05）,然而这三组之间上述基因的表达水平没有显著差异（P>0.05）。综上,这些结果说明了vaspin促进成骨的分化存在剂量依赖性但没有时间依赖性。9、Vaspin 可显著上调 β-catenin、Runx2、OSX、p-Smad2、p-Smad3、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3 的蛋白表达水平。采用vaspin（10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL）分别处理OB 48小时后,再应用 Western Blotting 法测定 β-catenin、Runx2、OSX、Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3 的蛋白表达水平。结果显示,vaspin 剂量依赖性地上调β-catenin、Runx2、OSX、p-Smad2、p-Smad3、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3 蛋白的表达水平（P<0.05）10、Vaspin可显著增加Runx2荧光细胞数。与对照组相比,10 ng/mL的vaspin组Runx2荧光细胞数无明显变化,50 ng/mL的vaspin则可显著增加Runx2荧光细胞数,而100 ng/mL的vaspin的上调作用最明显。结论:Vaspin能改善高脂饮食导致的体重增加和低代谢水平,拮抗高脂饮食导致的骨损害;Vaspin可通过激活Smad2/3-Runx2信号通路促进大鼠原代OB的成骨分化。