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背景:随着肿瘤患者年轻化以及生存率提高,化疗药物所致医源性损害逐渐得到重视。卵巢是生殖系统中对化疗最为敏感的部位,大剂量、长时间的化疗可破坏卵巢组织,导致卵巢早衰(premature ovarian failure,POF)。这些年轻患者迫切要求恢复生育能力,但目前尚无有效治疗方法。随着生物技术的发展,干细胞研究的不断深入,干细胞移植为修复化疗性损伤组织的结构和功能提供了可能性,也是近年来的一个研究热点。经血源性子宫内膜间充质干细胞(MB-MSCs)是一种新型的干细胞,它具有易于收集、安全、无创、无伦理问题和无自身免疫排斥等优点。课题组前期实验表明MB-MSCs能够修复化疗损伤性小鼠卵巢功能。本论文主要在体外研究MB-MSCs对化疗损伤性卵巢早衰的影响,应用密度梯度离心法分离培养人卵巢颗粒细胞(GCs),研究MB-MSCs对化疗损伤性GCs的影响,并进一步探讨MB-MSCs对化疗损伤性GCs修复作用及潜在机制。方法:1、应用密度梯度离心法分离、培养GCs;应用细胞免疫组织化学染色法(IHC)鉴定GCs:GCs的特异性抗体为促卵泡激素受体(FSHR);2、应用CCK8法检测表柔比星处理GCs的最适浓度。3、实验分为3组1)Control组:GCs;2)G+E组:25μg/L表柔比星处理的GCs;3)G+E+M组:25μg/L表柔比星处理后的GCs与MB-MSCs共培养。使用cell culuture insert将GCs与MB-MSCs进行共培养。各组分别干预48小时。培养结束后分别取Control组,G+E组,G+E+M组颗粒细胞及其上清液,用于后续实验。用酶联免疫吸附实验(ELISA)测定各处理组培养GCs的上清液中雌二醇,孕激素,抗苗勒管激素(AMH),抑制素A和抑制素B的含量,CCK-8法检测各处理组GCs增殖,PI单染检测各处理组GCs细胞周期分布,Affymetrix HTA 2.0基因芯片分别检测Control组与G+E组、G+E组与G+E+M组GCs的差异表达基因,Western blot对差异表达基因进行验证。结果:应用密度梯度离心法成功分离培养GCs;应用IHC法检测GCs特异性抗体FSHR,结果示GCs胞膜和胞质呈棕色染色,90%以上细胞膜和细胞质均呈棕褐;CCK-8检测表柔比星对GCs的细胞毒性,表柔比星对GCs的抑制作用与表柔比星的浓度和作用时间呈正相关,最适时间设定为24小时,相应的半数抑制浓度(IC50)为25μg/L。在研究中与Control组相比,G+E组GCs分泌的雌二醇,孕激素,AMH,抑制素A和抑制素B水平降低,GCs增殖抑制率升高,GCs在G2/M期比例增加(P<0.05),差异具有统计学意义,而G+E组相比,G+E+M组MB-MSCs修复表柔比星对GCs的损伤,雌二醇,孕激素,AMH,抑制素A和抑制素B水平增加,GCs增殖抑制率降低,GCs在G2/M期比例降低(P<0.05),差异具有有统计学意义。为了进一步研究MB-MSCs对表柔比星导致GCs损伤的修复作用的分子机制,我们使用微阵列和生物信息学分析结果显示对照组和G+E组之间存在18个差异表达基因,G+E组和G+E+M组之间存在7个差异表达基因参与细胞周期途径,包括差异表达基因Gadd45b(倍数变化>1.5,P<0.05)、CyclinB1(倍数变化>1.5,P<0.05)、CDC2(倍数变化>1.5,P<0.05)。Western blot法验证差异表达基因,结果发现与Control组相比,G+E组Gadd45b蛋白的表达增加,CyclinB1和CDC2蛋白的表达降低(P<0.05),差异具有统计学意义;而G+E组相比,G+E+M组Gadd45b蛋白表达降低,CyclinB1、CDC2蛋白表达增加(P<0.05),差异具有统计学意义。结论:表柔比星可降低GCs分泌性激素水平,抑制GCs的增殖,使GCs阻滞于G2/M期,而MB-MSCs改善GCs分泌性激素的水平,促进GCs的增殖,加快GCs细胞周期周转,MB-MSCs修复表柔比星对GCs的损伤可能与抑制Gadd45b蛋白表达有关。