研究背景:宫颈癌是女性生殖系统第一位的恶性肿瘤,全球每年大约有500,000名新发病例,其中80%在发展中国家,我国每年大约有10 000名新发病例,且近年来有年轻化趋势,高危型HPV 16、18感染作为宫颈癌的启动因素对于促进癌症的发展有至关重要的作用。目前手术和放、化疗是宫颈癌主要的治疗手段,但并发症、副作用、转移、复发和耐药等使其具有局限性,迫切需要一种更为有效的治疗方法来提高疗效,以期达到治愈宫颈癌的目的。近年来随着肿瘤干细胞的研究,证实肿瘤干细胞是肿瘤发生、转移、耐药和复发的根源,因此寻找一种特异性表达在肿瘤干细胞中的基因作为靶点会为宫颈癌的治疗带来突破。肿瘤干细胞的形成与发展主要与多种干胚胎基因、生殖干细胞基因和成体干细胞基因的是否重表达有关。虽然胚胎干细胞相关基因如POU5f1(Oct-4),Nanog,Lin28B,c-Myc和Sox2等可表达在肿瘤干细胞中,但其表达并不稳定且具有争议性,而生殖干细胞相关基因如Piwil2可稳定表达在各种肿瘤的肿瘤干细胞中,同时Piwil2可促进原癌基因或胚胎干细胞基因如c-Myc、Lin28B、Sox2等的表达并在肿瘤干细胞多步骤演变与分化中有重要作用,因此其可能作为肿瘤检测、诊断、治疗的一个重要标记物。Piwil2蛋白是AGO/PIWI蛋白家族的一种,正常情况下只表达在睾丸组织中,对于维持生殖干细胞的发育和配子的形成具有重要的作用。同时Piwil2蛋白可特异性表达在多种肿瘤组织和细胞系的肿瘤干细胞,从而使肿瘤干细胞具有自我更新和不断增殖等异常的表观遗传特性和恶性转化能力,有利于肿瘤的形成。细胞衰老是细胞受体内外多种因素的影响导致DNA断裂损伤、氧自由基累积、端粒缩短等致使生长代谢不可逆性停止的现象。主要受细胞色素依赖激酶抑制家族如P16基因调控,导致相应的端粒长度缩短及端粒酶活性降低等即细胞发生衰老,其中端粒的长度维持主要是由端粒逆转录酶h TERT决定。在多种肿瘤中P16的表达常缺如而h TERT的活性增高,而恢复P16表达的增加可抑制h TERT的表达。目的:沉默宫颈癌细胞中Piwil2基因的表达,观察其对细胞增殖和衰老等生物学特性的影响,并进一步探讨其相关的分子学机制。方法:(1)Sh-piwil2质粒采用脂质体Lipofectamine2000转染宫颈癌C33A和Hela细胞株,经嘌呤霉素筛选获得稳转细胞株C33A-sh Piwil2和He La-sh Piwil2,沉默Piwil2基因的表达;荧光显微镜镜检、Q-PCR和Western blot方法检测Piwil2沉默效果。(2)采用细胞增殖实验检测细胞增殖,集落形成实验观察细胞克隆形成能力。(3)采用流式细胞周期检测技术分析Piwil2沉默前后细胞周期分布的变化。(4)采用β-半乳糖苷酶染色法检测沉默Piwil2基因对细胞衰老的影响。(5)运用Q-PCR和Western blot方法检测沉默Piwil2对P16和h TERT表达的影响。结果:(1)建立C33A-sh Piwil2和Hela-sh Piwil2稳转细胞株;Q-PCR与Western blot结果显示,转染组Piwil2 m RNA与蛋白的表达水平均显著降低,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。(2)细胞增殖实验与集落形成实验均证明:与对照组相比,沉默Piwil2组细胞生长显著抑制,集落形成能力下降,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。(3)细胞周期检测结果显示:与对照组相比Piwil2沉默后细胞的G0/G1期比例增加,S期比例减少,组间差异有统计学意义(P<0.05)。(4)β-半乳糖苷酶染色结果显示:沉默Piwil2组细胞衰老比例显著增加,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。(5)Q-PCR与Western blot检测P16和h TERT表达:与对照组相比,Piwil2沉默后细胞P16表达上升,而h TERT的表达下降(P<0.05)。结论:(1)沉默Piwil2的表达可以抑制宫颈癌细胞增殖,促进细胞衰老;(2)其可能的分子机制是沉默Piwil2表达可上调P16、降低h TERT表达