TLR4/microRNA信号轴作为一种新的信号传导途径广泛的参与了体内各种病理和生理进程，因此针对该信号轴的靶向治疗措施极具临床应用前景。在本研究中，我们以小胶质细胞和脑缺血再灌注小鼠模型为研究对象，结合生物信息学、免疫学和分子生物学方法，对脑缺血再灌注后TLR4/microRNA信号轴对神经损伤的调控作用及具体机制进行深入研究。本研究分为3部分：1. TLR4激活上调miR-181a表达的机制研究既往研究表明，TLR4激活后可通过AP1、NF-κB和IRF等转录因子对microRNA的表达进行调控。本研究用TLR4激动剂Ec-LPS对小胶质细胞进行刺激，并通过DeepSequencing对比刺激前后小胶质细胞中的差异表达miRNAs谱。结果显示，TLR4激活后小胶质细胞内约有43中miRNAs水平上调4倍以上，27种miRNAs水平下调4倍以上。我们对部分变化显著的microRNA进行了qRT-PCR验证，发现TLR4激活后，miR-181a在小胶质细胞内表达显著上调。通过数据库查询得知，在miR-181a编码基因转录起始位点上游1976bp处有AP1的结合位点。我们克隆miR-181a上游启动子片段，利用双荧光报告基因研究AP1与miR-181a启动子的结合情况，结果显示AP1可与miR-181a启动子结合并调控基因的转录。在TLR4激活后，AP1敲除的小胶质细胞内的miR-181a水平要低于普通小胶质细胞。我们进一步发现，通过转染miR-181a inhibitor阻断miR-181a后，TLR4激活后小胶质细胞合成和释放的促炎症介质IL-1β和TNF-α的含量明显降低。这些结果表明TLR4可通过AP1上调小胶质细胞miR-181a表达水平，而miR-181a可能是TLR4促炎作用的一条重要的途径。2. miR-181a促进脑缺血再灌注后炎症反应和细胞凋亡上一部分研究提示miR-181a可能是TLR4促炎作用的重要途径。在本部分研究中，我们首先检测正常小鼠和缺血再灌注小鼠脑内miR-181a的表达，发现miR-181a在脑缺血再灌注后在脑组织内上调。为进一步研究miR-181a的体内作用，我们构建过表达miR-181a的AAV9质粒，通过尾静脉注射的方式使之在小鼠体内过表达。结果显示，转染AAV9质粒的小鼠大脑皮质和海马中都可检测到高强度的miR-181a载体绿色荧光表达。与普通小鼠相比，过表达miR-181a的小鼠在缺血再灌注后脑组织病理改变加重，梗死面积扩大且神经功能缺损评分增高。并且，miR-181a转染小鼠脑组织的炎症因子IL-1β和TNF-α含量高于普通小鼠，Tunel和Caspase3染色阳性细胞数也明显多于普通小鼠。此结果提示miR-181a在脑缺血再灌注后表达上调，并促进再灌注后的炎症反应和细胞凋亡，从而加重神经损伤。3. miR-181a通过下调TGFBR1的表达从而抑制TGF-β/SMADs信号通路传导本研究第1、2部分显示TLR4通过AP1引起miR-181a上调，而miR-181a可促进脑缺血再灌注后炎症反应和细胞凋亡，加重神经功能缺损，因此TLR4与miR-181a构成信号轴对脑缺血再灌注后神经损伤反应进行调控。但TLR4/miR-181a轴的下游靶点与具体调控机制还未明确。在本部分研究中，我们通过生物信息学方法对miR-181a的下游靶点进行预测，共找到900个可能靶基因。其中包括重要的神经保护因子TGF-β的受体TGFBR1。因此我们以TGFBR1为预测目标继续进行验证研究。本实验westernblot结果证实，miR-181a mimic可下调BV2细胞中TGFBR1蛋白的表达，而miR-181a抑制剂——miR-181a inhibitor可促进其蛋白表达。qRT-PCR结果发现miR-181a对TGFBR1mRNA表达并无明显影响。Luciferase assay显示，转染miR-181a mimic后，含野生型TGFBR1的3’-UTR段的荧光报告质粒的荧光表达强度明显降低，含其中任一位点突变的荧光报告质粒的荧光表达也分别有所下降，而含miR-181a两结合位点完全突变的荧光报告质粒的荧光表达强度则不受影响。本研究还发现，给予脑缺血再灌注小鼠AAV9-miR-181a质粒后，小鼠脑内的TGFBR1含量减少，其下游信号分子p-SMAD2和p-SMAD3含量也明显降低。这些结果充分提示了miR-181a可在转录后水平下调TGFBR1的表达，并在脑缺血再灌注后抑制TGF-β1/SMADs信号途径的转导。结合前两部分内容，我们认为TLR4和miR-181a形成信号轴对TGF-β1/SMADs信号通路起到抑制作用，从而加重脑缺血再灌注后的炎症反应和细胞凋亡。