目的:　　结核病（tuberculosis，TB）是全球最严重的传染性疾病之一，是传染病的第一号杀手，严重危害人类健康和社会发展。卡介苗（Bacille Calmette-Guerin，BCG）是TB唯一的预防性疫苗，目前在全球范围内广泛接种，用于预防婴儿和儿童TB。通常认为BCG的保护期仅10-15年，不能对成人TB提供有效的保护性，因而在控制全球TB流行的作用较为有限。因此，研制更有效的疫苗，对实现世界卫生组织和联合国提出的“2035年终止TB的流行”的目标，至关重要。　　过去30年来，在TB疫苗方面的研究和开发方面进展缓慢：从20世纪90年代初期在新型TB疫苗候选几乎处于空白状态，到现在，仍只有十二种新型疫苗正在进行人体临床试验，但仍无一种新型疫苗能通过临床试验并投入市场。因此，正在寻求创新方法来进一步改进现有疫苗和研发新的TB疫苗。　　前期，已证实本实验室构建的多阶段抗原融合蛋白亚单位疫苗CMFO/DMT，抗原发感染的保护性与BCG相当，且能提供比BCG更强的抗潜伏感染的保护性。尽管多阶段抗原融合蛋白和新型佐剂组成的亚单位疫苗CMFO/DMT在控制潜伏感染方面具有重要作用，但由于在全球范围内的成人，在新生儿阶段均可能被BCG免疫过，亚单位疫苗CMFO/DMT加强免疫，能否加强BCG初免抗原发感染的免疫原性和免疫保护性，以延长BCG的保护期，仍有待研究。　　方法:　　1.融合蛋白CMFO的纯化和定量：原核表达后进行蛋白纯化，并使用SDS-PAGE电泳后进行考马斯亮蓝染色；用Anti-his抗体作为一抗，进行western blot鉴定；BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量；用内毒素试剂盒去除蛋白中的内毒素，并用内毒素检测试剂盒进行内毒素检测。　　2.CMFO/DMT疫苗制备：分别取DDA、MPLA、TDB用薄膜法制作DMT佐剂，并与CMFO蛋白混合制成CMFO/DMT。　　3.小鼠免疫：分别用PBS、BCG、CMFO/DMT疫苗进行单独免疫和BCG初免后的加强免疫。于免疫12w、18w后，分别处死小鼠，无菌环境下解剖取所需组织，进行免疫原性检测。　　1）流式细胞术检测：免疫小鼠脾脏CMFO抗原特异性IL-2+CD4+T、IFN-γ+CD4+T、IL-2+CD8+T、IFN-γ+CD8+T、IL-2+CD4+TCM、IFN-γ+CD4+TEM、IL-2+CD8+TCM、IFN-γ+CD8+TEM细胞数量。　　2）CBA检测：免疫小鼠脾细胞与CMFO蛋白及亚组分共培养上清的Th1、Th2、Th17细胞因子含量。　　3）ELISA检测:免疫小鼠外周血血清中CMFO特异性抗体IgG、IgG1、IgG2a滴度，以及CMFO亚组分特异性抗体IgG、IgG1、IgG2a滴度。　　结果:　　1.SDS-PAGE及western blot证实成功表达并纯化CMFO蛋白；内毒素检测结果符合标准。　　2.成功制备DMT佐剂，并成功构建亚单位疫苗CMFO/DMT；亚单位疫苗内毒素含量符合免疫标准。　　3.第12、18w，PBS组只产生低水平CMFO特异性T细胞，各疫苗组相对PBS对照组，均可产生高水平的CMFO抗原特异性T细胞（p＜0.05），其中，CMFO/DMT组产生的CMFO特异性T细胞水平最高。CMFO/DMT组的IL-2+CD4+T、IFN-γ+CD4+T、IL-2+CD8+T、IL-2+CD4+TCM、IFN-γ+CD4+TEM、IFN-γ+CD8+TEM细胞均比BCG组高，且随时间延长IL-2+CD4+TCM、IFN-γ+CD4+TEM细胞增加。BGC-CMFO/DMT组12、18w的IL-2+CD4+T、IFN-γ+CD8+T、IL-2+CD8+TCM、IFN-γ+CD8+TEM细胞水平，与BCG组无差别或比BCG组低，且12w的IFN-γ+CD4+T、IL-2+CD8+T、IL-2+CD4+TCM细胞水平，比BCG组低。BCG-BCG组，在12、18w的IL-2+CD4+T细胞和12w的IFN-γ+CD8+T、IFN-γ+CD4+TEM、18w的IFN-γ+CD8+TEM细胞水平低于BCG组；随时间延长，BCG-BCG，出现IL-2+CD4+T、IFN-γ+CD4+T、IL-2+CD8+T、IFN-γ+CD8+TEM细胞水平下降。BCG组18w相对12w出现IFN-γ+CD8+T、IL-2+CD8+TCM细胞的下降。　　4.BCG免疫组相比CMFO/DMT组12w的IFN-γ、TNF-α水平和18w的IFN-γ水平均比BCG组高，且18w的IL-10低于BCG组，且随时间延长，IFN-γ分泌增加而TNF-α、IL-10水平不变。BCG-CMFO/DMT组12w的IFN-γ、IL-10和18w的IFN-γ均比BCG组高，其余均与BCG组无差别。且随时间延长，IFN-γ和IL-10分泌都增加。BCG-BCG组与BCG组在不同时间点的IFN-γ、TNF-α、IL-10水平均无明显差异。且随时间延长，TNF-α、IL-10水平都增加。在四种亚组分中Rv2073c刺激产生的IFN-γ最强，Rv3044刺激产生TNF-α最高，Rv0577刺激产生IL-10最高。CMFO融合蛋白刺激细胞产生的IFN-γ、TNF-α、IL-10均比其亚组分高。　　5.CMFO/DMT组脾细胞具有较强的分泌CMFO特异性抗体的能力，其CMFO特异性IgG、IgG1、IgG2a抗体水平均高于BCG组，且随时间延长，IgG水平上升。相对BCG组，BCG-CMFO/DMT组在12w的IgG、IgG1、IgG2a与BCG组无差异。随时间延长，IgG2a/IgG1下降。相对CMFO/DMT单独免疫组，BCG-CMFO/DMT组的IgG和12w的IgG1、18w的IgG2a均出现下降。BCG-BCG组与BCG组在不同时间点上IgG、IgG1、IgG2a、IgG2a/IgG1均无显著性差异，且随时间延长无显著变化。CMFO/DMT组在诱导Rv0577、Rv2073c、Rv2875特异性IgG抗体滴度均高于BCG对照组，且在诱导四种亚组分产生的IgG1、IgG2a均高于BCG组。　　结论:　　1.新型亚单位疫苗CMFO/DMT具有较强的抗TB原发感染的免疫原性，是有发展前景的成人TB的新型候选疫苗。　　2.CMFO/DMT可能不能加强BCG初免抗原发感染的免疫原性。尚需进行免疫动物的毒株攻击试验证实。