【摘 要】
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ATP-结合盒式转运蛋白(ABC转运蛋白)家族作为最大的膜蛋白家族之一,是重要的生物膜功能承担者。在细胞的膜环境中,ABC转运蛋白能够利用水解ATP释放的能量来实现诸多营养物质、代谢产物以及有毒物质的跨膜运输,从而维持细胞和机体代谢网络的平衡。正因为其功能的广泛性和重要性,ABC转运蛋白与人类疾病、癌细胞抗药性以及细菌耐药性的产生密切相关。胆固醇作为哺乳动物细胞膜组分中丰度最高的脂质之一,对细胞膜
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ATP-结合盒式转运蛋白(ABC转运蛋白)家族作为最大的膜蛋白家族之一,是重要的生物膜功能承担者。在细胞的膜环境中,ABC转运蛋白能够利用水解ATP释放的能量来实现诸多营养物质、代谢产物以及有毒物质的跨膜运输,从而维持细胞和机体代谢网络的平衡。正因为其功能的广泛性和重要性,ABC转运蛋白与人类疾病、癌细胞抗药性以及细菌耐药性的产生密切相关。胆固醇作为哺乳动物细胞膜组分中丰度最高的脂质之一,对细胞膜环境的稳定性和流动性有着十分重要的调节作用,也是甾醇类激素和维生素的前体物质。机体胆固醇代谢的网络受到一系列通路的精细调控,其中胞内胆固醇外排的主要途径被称为胆固醇逆转运(RCT)。巨噬细胞的RCT异常将直接导致动脉粥样硬化的发生,而动脉粥样硬化引发的冠心病已经成为目前全球致死人数最高的疾病。在RCT通路中,人类ABC转运蛋白ABCG1负责将细胞内的胆固醇呈递给胞外的胆固醇接收器—高密度脂蛋白(HDL),以缓解胆固醇的胞内累积。在本课题的第一部分工作中,我们使用单颗粒冷冻电镜技术解析了人类ABCG1E242Q突变体与ATP和胆固醇分子的复合物结构,整体分辨率达到了 3.26(?)。该结构整体呈现向内开口的构象。由于同时结合了 ATP和底物分子,ABCG1处于构象变化交替的中间态(turnover state)。基于结构分析,生化和细胞实验,我们鉴定了 ABCG1蛋白与底物胆固醇相互作用的氨基酸残基,阐释了蛋白-底物的相互作用模式。我们发现了在底物口袋出口处存在一组对于底物转运十分关键的苯丙氨酸残基。同时,我们的生化实验揭示了 ABCG1蛋白活性与胆固醇接收器的正相关性。我们还通过质谱鉴定发现在蛋白底物结合口袋附近,存在特异性结合的鞘磷脂组分,结构分析和功能实验结果均显示该鞘磷脂分子对ABCG1介导的胆固醇转运具有重要作用。基于结构分析和功能研究,我们提出了可能的ABCG1介导的胆固醇外排机制模型:鞘磷脂协助胆固醇与ABCG1结合并通过参与结合口袋的形成而稳定底物分子,而细胞外部的胆固醇接收器促进胆固醇从ABCG1底物口袋出口的释放。这些研究结果不仅揭示了 ABCG1与胆固醇的相互作用模式以及胆固醇接收器对于胆固醇外排转运的重要性,完善了我们对于胆固醇代谢网络的理解,还拓展了磷脂分子调节和参与膜蛋白功能的重要作用。维生素B12(钴胺素)是一种人类必需的微量营养物质,也是两种重要变位酶的辅酶因子,对红细胞的产生、神经系统的发育等生理代谢过程有着重要影响。维生素B12在细胞中的代谢需要先经过在溶酶体中的加工再释放进入细胞质完成后续的生化反应。人类ABC转运蛋白ABCD4被认为参与了维生素B12从溶酶体向细胞质的外排,研究表明编码ABCD4的基因突变能够引起维生素B12代谢疾病CblJ。在本课题的第二部分工作中,我们解析了分辨率为3.6 (?)的人类ABCD4E549Q突变体与ATP分子复合物的冷冻电镜结构。该状态下的ABCD4因结合了两分子ATP而发生了核酸结合结构域(NBD)的二聚化,呈现向溶酶体基质开口的构象,展现了该蛋白在水解ATP分子前瞬间的状态。我们还对ABCD4蛋白基本的酶学性质进行了检测,并基于解析的结构对临床致病突变的致病机制进行了阐释。
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