研究目的: 研究Poly I：C和As2O3对肝癌细胞株生物学特性的影响，探究其作用机制，探讨两者联合治疗在肝细胞癌的作用机制，探寻两药联合的协同作用，为进一步临床应用提供实验依据。 研究方法: 1、采用DMEM培养基常规培养人肝癌细胞株SMMC-7721，细胞培养至对数生长期后进行实验。实验设置分组：空白对照组、Poly I：C单药组、三氧化二砷单药组、Poly I：C联合三氧化二砷组。检测细胞增殖抑制率时，Poly I：C终浓度为50μg/ml、100μg/ml和200μg/ml；三氧化二砷剂量分别为4μmol/L、8μmol/L；Poly I：C联合三氧化二砷组的药物剂量是100μg/ml+4μmol/L。 2、以CCK-8法检测24、48、72h各时间点各组药物对人肝癌细胞SMMC-7721增殖的OD值。根据OD值计算细胞生长抑制率。 3、采用碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）染色法用流式细胞仪于各组药物作用后48h检测细胞周期的分布。 4、采用AnnexinⅤ-FITC/PI双染法，流式细胞仪于各组药物作用后24、48h检测细胞凋亡率。同上4个分组，另设置TLR3中和抗体组，N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）拮抗组，分组用流式细胞仪于各组药物作用后24h检测细胞凋亡率。 5、采用荧光定量PCR检测不同浓度Poly I：C作用24h后，TLR3信号通路中TLR3、TRIF、IFN-βmRNA的表达。 6、采用DCFH-DA荧光探针进行细胞内活性氧检测，用流式细胞仪检测各组药物作用24h后荧光强度的变化。 7、采用罗丹明123（Rhodamine123）作为荧光探针，用流式细胞仪检测各组药物作用24h后细胞线粒体膜电位变化。 8、采用比色法检测各组药物作用24h后Caspase-3，8，9活化程度。 9、各组药物作用后48h提取蛋白，Western blot法检测各组细胞凋亡相关分子Bcl-2、Bax、Bid、Survivin蛋白表达水平。 10、统计分析：采用SPSS13.0统计软件进行分析。实验数据用均数±标准差（x±s）表示。不同药物浓度及不同作用时间与处理效应间的关系采用析因分析。两样本均数的比较采用Independent-Samples T Test。多组间均数比较采用One-way ANOVA，方差不齐的采用Welch近似方差分析。组间多重比较方差齐性采用LSD法，方差不齐的采用Dunnett T3法。显著性标准为α=0.05。P<0.05有统计学意义。 研究结果: 第一部分 Poly I：C对SMMC-7721细胞生物学特性的影响 1、在同一时间点，不同浓度的Poly I：C50μg/ml、100μg/ml和200μg/ml的增殖抑制率的差异均有统计学意义（P<0.001）。分别对不同浓度的Poly I：C分析，Poly I：C50μg/ml、100μg/ml和200μg/ml在三个不同时间点的差异均有统计学意义（P<0.01），进一步两两比较显示，随着时间的增加，Poly I：C50μg/ml、100μg/ml和200μg/ml对SMMC-7721细胞的抑制率均增大。Poly I：C对SMMC-7721细胞的增殖抑制存在时间、剂量依赖效应。 2、Poly I：C作用48h后，SMMC-7721细胞周期发生变化，随药物浓度增加，G0/G1期细胞比例逐渐增多，S期的细胞逐渐减少，不同浓度各组间比较差异有显著性（P<0.05），说明Poly I：C可使SMMC-7721细胞生长阻滞于G0/G1期。 3、SMMC-7721加入不同浓度Poly I：C后采用AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测，结果显示细胞均出现不同程度的凋亡。不同浓度Poly I：C诱导的凋亡率依次增高，有显著差异（P<0.001）。同一浓度，不同作用时间的细胞凋亡率存在差异，有统计学意义，提示随着Poly I：C作用时间的延长凋亡率也逐渐增加（P<0.001）。 4、荧光定量PCR检测Poly I：C作用后TLR3、TRIF、IFN-βmRNA的表达，结果以两组间目的基因拷贝数的比值表示。结果显示三者均有增高，并随Poly I：C浓度增加表达量增加明显。Poly I：C作用24h后，三个不同浓度间比较差异有显著性（高、中浓度组比低浓度组和对照组P<0.05；高浓度比中浓度组P<0.001）。 第二部分 As2O3对SMMC-7721细胞生物学特性的影响 1、在同一时间点，不同浓度的As2O34μmol/L、8μmol/L的增殖抑制率的差异均有统计学意义（P<0.001）。分别对不同浓度的As2O3分析，As2O34μmol/L、8μmol/L在三个不同时间点的差异均有统计学意义（P<0.01），进一步两两比较显示，随着时间的增加，As2O34μmol/L、8μmol/L对SMMC-7721细胞的抑制率均增大。As2O3对SMMC-7721细胞的抑制存在剂量、时间依赖效应。 2、As2O3作用48h后，SMMC-7721细胞周期发生变化，随药物浓度增加，G2/M期细胞比例逐渐增多，S期的细胞逐渐减少，两种浓度间比较差异有显著性（P<0.05），说明As2O3可使SMMC-7721细胞生长阻滞于G2/M期。 3、在同一时间点，不同浓度的As2O34μmol/L、8μmol/L均能诱导SMMC-7721的凋亡，且凋亡率存在差异，有统计学意义（P<0.001）。分别对不同浓度的As2O3分析，4μmol/L和8μmol/L在不同时间点的差异均有统计学意义（A1：P<0.001，A2：P=0.001）。随着时间的增加，As2O34μmol/L、8μmol/L对SMMC-7721细胞的增殖抑制率均增大。As2O3对SMMC-7721细胞的增殖抑制存在时间依赖效应。 第三部分 Poly I：C和三氧化二砷联合对肝癌细胞株生物学特性的影响及机制 1、在同一时间点，Poly I：C100μg/ml和不同浓度的As2O3联合应用的增殖抑制率的差异与单药As2O3相比，均有统计学意义（P<0.001）。同一药物作用组，24h和48h之间的增殖抑制率存在差异，均有统计学意义（P<0.001）。浓度As2O34μmol/L、8μmol/L分别与Poly I：C100μg/ml组成联合组作用于SMMC-7721细胞分析可知两药存在交互效应（P<0.001），随着药物浓度的增大，抑制作用增强。 2、细胞周期分布显示与对照组相比，Poly I：C主要使G0/G1期细胞增加（P<0.05），As2O3可使SMMC-7721细胞生长阻滞于G2/M期（P<0.05）。联合用药后细胞主要阻滞在G0/G1期和G2/M期（P<0.05）。联合用药对细胞增殖周期的抑制更为显著。 3、在同一时间点，Poly I：C100mg/ml单药、As2O34μmol/L单药、As2O34μmol/L+Poly I：C100mg/mL联合组之间诱导凋亡率的差异有统计学意义（P<0.01）。 4、活性氧检测分析显示Poly I：C组、As2O3组以及联合用药组诱导细胞产生ROS，均较对照组增强，差异有显著性（P<0.05）。 5、线粒体膜电位检测显示Poly I：C组、As2O3组以及联合用药组较对照组发生不同程度降低，差异有显著性（P<0.05）。 6、Caspase-3，8，9活性检测显示：As2O3单药、Poly I：C单药和联合组与对照组比较均有差异有统计学意义（P<0.05）。进一步两两比较显示，联合组较Poly I：C单药、As2O3单药、对照组的Caspase-3，8，9活化程度均有统计学意义（P<0.05）。 7、Western blot结果显示：表明Poly I：C、As2O3和联合用药均可下调Bcl-2蛋白的表达，As2O3组比Poly I：C组明显（P<0.001）。 结论: Poly I：C及三氧化二砷对SMMC-7721肝癌细胞均有抑制增殖和诱导细胞凋亡作用，呈时间和剂量依赖性，两药联合具有协同作用。Poly I：C阻滞细胞周期于G0/G1期，三氧化二砷阻滞细胞周期于G2/M期。Poly I：C通过TLR3途径诱导产生干扰素β，激活FADD-Caspase-8外源性凋亡途径；并产生ROS，降低Bcl-2蛋白表达，促进Bax蛋白表达，活化Bid蛋白，激活线粒体凋亡途径诱导肿瘤细胞凋亡。同时可藉由干扰素发挥免疫调节作用。三氧化二砷可以诱导细胞产生ROS，降低Bcl-2、Survivin蛋白表达，促进Bax蛋白表达，活化Bid蛋白，激活线粒体凋亡途径诱导细胞凋亡。联合用药可明显增加对凋亡相关分子影响的广度和强度，激活外源性凋亡途径和线粒体凋亡途径，协同的诱导肝癌细胞凋亡。