均相电化学与光电化学新方法研究及其在生物酶活性检测中的应用

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生物酶作为一种高效的生物催化剂,广泛存在于动、植物体内。生物酶的种类很多,性质和催化活性也各有不同,主要通过催化机体内各种生化反应来调节各项生命活动,以保证机体的正常运行。一旦生物酶活性出现异常,将会导致许多疾病,因此对于生物酶活性的检测越来越受到人们的关注。近年来,均相电化学、光电化学生物传感器作为重要的新型生物传感器,已广泛应用在DNA、酶以及其它生物小分子的检测中,并表现出灵敏度高、选择性好、设备简单价廉等优点。此外,农药作为生物酶活性抑制剂,在完成生物酶活性检测的同时,可实现对其检测。基于上述研究背景,本文的主要内容有:  首先,基于单分子信标引发的 T7核酸外切酶辅助循环放大技术,构建均相电化学生物传感平台,实现ALP活性便捷、高灵敏检测。实验中巧妙设计3'端标记磷酸基团、5'端修饰亚甲基蓝(MB)的发卡DNA探针(HP),当目标物ALP存在时,包括HP去磷酸化、KF聚合酶催化的DNA链的聚合延伸、T7核酸外切酶对发卡探针双链部分的催化水解等一系列反应将会发生,从而释放标记电活性物质亚甲基蓝(MB)的单核苷酸和触发DNA(tDNA)。tDNA就会与溶液中其它未发生反应的HP继续杂交,引发后续的循环剪切过程,最终释放大量标记MB的单核苷酸,产生显著放大的电化学信号,从而实现ALP活性的高灵敏检测。采用该方法得到的直接检出限低至0.1 U/L,可与荧光检测方法的检出限相媲美,同时比之前文献报道的基于固定方法的电化学策略的检出限低3个数量级。除了具备灵敏度高、选择性好的优点外,由于测定过程是在均相溶液中进行,省去了复杂的电极修饰过程,该策略还展现出操作简单、方便、快捷等优势。因此,本文所提出的均相电化学生物传感器对于生化研究和临床实践中ALP活性检测来说是一个理想的选择。  其次,基于酶催化产物介导原位合成 CdS量子点,建立新型双相光电化学生物传感方法,在保证乙酰胆碱酯酶(AChE)最佳活性状态下,实现AChE活性及其抑制剂便捷、高灵敏检测。底物硫代乙酰胆碱(ATCh)经AChE催化水解,其产物硫代胆碱可以在均相溶液中辅助原位合成CdS量子点。通过静电吸引作用,上述表面叔胺基功能化的CdS量子点将吸附到带负电的ITO工作电极表面,经光激发后,在电子供体存在的条件下,产生显著的光电化学响应信号。通过充分利用在均相溶液中原位合成CdS量子点这一优势,该策略可确保在AChE最佳活性状态下完成对其活性及抑制剂的检测。采用上述方法得到的直接检出限为0.01 mU/mL,优于之前文献报道的一些荧光检测策略。此外,成功实现了涕灭威对AChE活性抑制的研究,相应的半数抑制浓度IC50为13μg/L。除了具备灵敏度高、选择性好的特点外,该策略还表现出简单、价廉、易操作的优势。据我们所知,这是首次将均相溶液中原位合成的CdS量子点用于双相光电化学检测AChE活性及其抑制剂。更重要的是,该双相光电化学传感策略为均相光电化学传感平台的发展提供了新思路与新方向,并有望应用于多种目标物的检测。
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