宫颈癌是女性常见恶性肿瘤和癌症相关死亡原因之一,严重威胁女性健康与生命。宫颈癌也是迄今病因最为明确的肿瘤,业已确认,高危人乳头瘤病毒(HR-HPV)感染是宫颈癌发生的必要因素。大量证据表明,从HPV感染到宫颈癌的发生是一个渐进的、缓慢的过程,存在明确的癌前期病变阶段,即宫颈上皮内瘤变(CIN),这为我们提供了有利的阻断时机,但目前针对CIN的治疗手段仍以毁损性手术为主,尚缺乏无创、特效的阻断方法。转化医学概念的提出为我们提供了新的研究思路,如何利用临床HPV感染和宫颈病变进展模型发现HPV感染和宫颈癌发生的核心靶标或作用通路继而用以指导临床诊断和治疗,是研究阻断宫颈癌发生新方法的核心问题。本课题将基于这一思路开展前期研究。利用生物芯片技术筛选HPV感染过程中宫颈组织miRNA表达谱,筛选可以用于HPV感染和宫颈病变发生过程中早期诊断、预测和靶向治疗的miRNA标志物,是宫颈癌转化研究中的首个重点。由于miRNA各种生物学功能的发挥本质上都是通过调控靶基因的表达实现的,不仅表现在表达丰度的调控,同时也包括基因结构如剪切亚型的调节,因此,miRNA组学水平的研究与转录组学的研究密不可分。第二代高通量测序技术与生物芯片技术相结合,整合miRNA组学与mRNA转录组学研究结果,结合体外3’UTR分析,将从体内全基因组水平为miRNA靶体作用机制研究提供新的研究思路,为从"RNA组学”的整体水平对HPV感染和宫颈癌致癌机制的系统性研究奠定基础。同时,人体生殖道系统是一个菌群复杂的微生物环境,迄今尚不明确HPV持续感染是否与生殖道微生态失调有关,是否有其它病原体感染促进了HPV的持续感染或恶性转化；而且由于HPV病毒体外分离与培养的困难性,至今对体内标本中HPV全基因组结构与功能的研究仍然有限。Phi29聚合酶介导的滚环DNA复制技术可以不依赖于微生物的培养体系而对之进行有效扩增,其产物进行深度测序后可以用于全基因组分析,有助于HPV病毒基因结构、表达方式和种属关系的深入研究,明确生殖道微环境与HPV感染的关系,并在HPV感染和宫颈癌的作用机制研究中首次引入宫颈宏基因组学(metagenome)的概念。本研究将基于生物芯片和第二代测序等高通量分析技术,首先通过对miRNA组学、转录组学和以HPV为典型代表的宏基因组学水平展开多角度、全方位的整合和贯穿研究,筛选可以用于HPV感染和宫颈癌早期诊断及评估患者预后的分子标志物和药物靶标；随后在已完成HPV感染过程中宫颈组织miRNA表达谱的筛选和一系列生物信息学分析基础上,针对特定miRNA展开功能研究。以期建立宫颈癌转化研究的理论体系和实验平台,为日后架起一座沟通实验室与临床之间的转化桥梁夯实基础。第一部分HPV感染和宫颈癌发生过程中的全基因组研究目的通过高通量分析技术,对miRNA组学、转录组学和以HPV为典型代表的宏基因组学水平展开多角度、全方位的整合和贯穿研究,以宫颈组织中差异表达的miRNA为代表,筛选可以用于HPV感染和宫颈癌早期诊断及评估患者预后的分子标志物和药物靶标,为宫颈癌的转化研究提供完整而全新的分子生物学信息,并为后续体外功能学实验研究奠定坚实的基础。方法首先利用Paraflo miRNA芯片,初步确定6例HPV阴性正常宫颈组织、7例单纯HPV16阳性正常宫颈组织、6例单纯HPV16阳性CIN2-3、6例单纯HPV16阳性宫颈癌组织中的不同miRNA表达特征,并通过芯片差异显著性分析(SAM)和深度分析(In-depth analysis),筛选宫颈癌发生过程中差异表达的miRNA,然后对其进行生物功能学分析(Gene ontology, GO),并利用miRNA靶体数据库和GENE数据库,筛选与HPV感染相关的miRNA靶基因,构建“HPV感染相关的miRNA/靶体基因”网络图。通过Real-time PCR对6个miRNA(miR-29a↓, miR-375↓,miR-195↓,miR-99a↓,miR-155↑,miR-92a↑)在133例宫颈组织中进行表达检测,验证miRNA芯片数据的准确性,并明确这6个miRNA在正常宫颈组织、HPV感染CIN 2-3和宫颈癌中的表达特征。其次,通过方向特异性RNA测序(Directional Ligation sequencing,DeLi-seq)技术,对10例正常和宫颈病变组织(正常宫颈组织3例、CIN2-3组织4例、宫颈癌组织3例)进行mRNA水平的高通量测序分析,明确HPV病毒和宫颈细胞全基因组转录本的结构和表达水平,发现与HPV感染和宫颈病变相关的未知正义链或负义链转录本,精确地识别已知或未知的可变剪切亚型。最后,通过滚环DNA扩增(rolling cycle amplification,RCA)技术对20例女性宫颈CIN2-3和宫颈癌组织标本中的短的、环状DNA序列进行富集,并对长的、线性DNA进行高效扩增,构建非体外培养体系下病毒或细菌感染的宫颈病变组织全基因组DNA文库,通过illuminal GAII第二代测序平台,完成宫颈宏基因组的测序工作,然后通过有效的生物信息学算法和分析软件对海量测序信息进行归纳分析,包括通过定位算法将所有测序读段与已知的132个已知序列的HPV全基因组序列进行定位分析,确定临床宫颈病变组织样本中HPV DNA的全基因组的病毒拷贝数、HPV的感染状态(单纯感染与混合感染)、分析常见型别的HPV全基因组突变位点、识别新的HPV基因型别或病毒变异体等,并通过与生殖道常见病原体支原体和衣原体等已知基因组序列进行比对和从头拼接算法,明确宫颈病变细胞中是否存在HPV以外的已知或未知病原体的混合感染。结果1.HPV阴性正常宫颈组织、HPV16阳性正常宫颈组织、单纯HPV16阳性CIN2-3、单纯HPV 16阳性宫颈癌组织4组进行单因素方差分析(ANOVA),52个miRNA的表达有显著性差异(p<0.05),其中31个miRNA在HPV阴性正常宫颈组织、HPV 16阳性CIN 2-3、HPV 16阳性宫颈癌组织3组中有显著性差异(ANOVA,p<0.05).2.通过Real-time PCR对6个miRNA(miR-29a,miR-375,miR-195,miR-99a, miR-155,miR-92a)在133例宫颈组织中进行表达检测,充分验证了miRNA芯片数据的准确性,并明确了这6个miRNA在正常宫颈组织、HPV感染CIN2-3和宫颈癌中的表达特征。3.对31个差异表达的miRNA进行生物功能学分析(Gene ontology,GO),并利用miRNA靶体数据库和GENE数据库(NCBI),筛选与HPV感染相关的miRNA靶基因,并根据miRNA-靶基因关联强度,构建了“HPV感染相关的miRNA/靶基因”关系网络图。4.通过方向特异性RNA测序(DeLi-seq)和滚环DNA扩增基础上的基因组深度测序,确定了在宫颈病变过程中HPV和细胞基因组整体表达量和转录本结构的改变；并根据HPV常见感染型别的全基因组结构和转录特点,构建了HPV16、HPV58的全基因组突变位点和转录图谱。结论1.识别了不同HPV感染状态的宫颈组织miRNA表达谱,31个miRNA可能与宫颈癌发生相关；随着宫颈病变的进展,miR-375,29a,99a,195的表达呈下调趋势,miR-92a,155的表达呈上调趋势；miRNA芯片和定量PCR检测两种方法的一致性较好,后者的差异显著性更为明显。2.构建了“HPV感染相关的miRNA／靶体基因”网络图,提示miR-29可能是与HPV致癌过程关系最为密切的miRNA: miRNA可能通过细胞周期等生物学功能参与HPV相关的宫颈癌发生过程。3.测序结果表明宫颈病变过程中存在HPV和细胞基因组转录方式和基因表达量的整体改变；根据HPV常见感染型别的全基因组结构和转录特点构建了HPV16、HPV58的全基因组突变位点和转录图谱,为后续功能研究奠定了基础。第二部分特定miRNA在HPV感染和宫颈癌中的作用及机制研究目的通过体内宫颈组织标本相关性分析和体外功能学实验,明确miR-29对HPV相关靶基因YY1/CDK6的直接调控作用和对细胞生物学行为的影响,从而确定其在HPV感染相关宫颈癌发生中的作用及分子机制；并通过体内组织标本中miR-29和miR-224的表达水平检测和相关性分析,及体外细胞株中HPV感染与miRNA表达正反两方面的调控,探索特定miRNA在HPV感染中的作用。方法通过Real-time PCR、免疫组织化学等方法检测HPV感染不同状态下宫颈病变组织中YY1、CDK6的表达水平,并通过Sperman相关性分析明确miR-29与YY1、CDK6的表达相关性；利用miR-29 mimic转染宫颈癌SiHa细胞株,通过Real-time PCR和Western blot检测YY1、CDK6在nRNA和蛋白水平的表达改变,并利用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡的改变。随后通过以下几方面探讨特定miRNA(miR-29和miR-224)与HPV感染的相互调控关系：通过Real-time PCR检测HPV16阳性宫颈CIN和宫颈癌组织中miR-29与E6/E7表达水平,并进行相关性分析；通过Real-time PCR检测HPV阳性/阴性正常宫颈组织中miR-29的表达水平,分析其与HPV感染的关系；通过转染miR-29 mimic调控HPV16阳性宫颈癌细胞中的miR-29表达水平,利用Real-time PCR和Western blot检测E6/E7 mRNA和蛋白水平的变化；通过在HPV16阳性宫颈癌细胞株中转染E6/E7 siRNA或在HPV阴性宫颈癌细胞株中转染HPV16 E6/E7表达质粒,利用Real-time PCR检测miR-29的表达改变。通过Real-time PCR、Northern Blot等方法检测HPV感染不同状态下宫颈病变组织和体外HPV感染筏式培养组织中miR-224的表达水平,分析miR-224与HPV感染及与病毒基因如E6/E7的表达相关性；通过在各种HPV阳性宫颈细胞株中转染病毒基因E6/E7的siRNA,及在HPV阴性细胞株中转染HPV基因表达质粒,利用Real-time PCR检测miR-224的表达改变；利用miR-224 mimic或inhibitor转染细胞,通过Real-time PCR和Western blot检测HPV E6/E7在mRNA和蛋白水平的表达改变,并利用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡的改变；通过报告基因检测系统和miRNA表达调控体系明确miR-224的下游靶基因和作用通路。结果1.宫颈组织中YY1、CDK6的表达与miR-29水平呈明显负相关性；YY1、CDK6在HPV感染不同宫颈病变组织中的表达有显著性差异,且随着病变级别的增加而逐渐上调表达；HPV16阳性宫颈病变组织中,YYl、CDK6与E6/E7的表达呈明显正相关性。2.宫颈癌细胞SiHa中上调miR-29的表达,可以引起YY1、CDK6在mRNA和蛋白水平的下降；并可以诱导细胞G1期阻滞和细胞凋亡。3.HPV16阳性宫颈病变组织中,miR-29与E6/E7的表达呈明显负相关性；miR-29在HPV阳性/阴性正常宫颈组织中的表达无显著性差异；SiHa细胞中上调miR-29的表达,不引起HPV E6/E7的表达改变；SiHa细胞中转染HPV16 E6/E7siRNA,不引起miR-29的表达改变；HPV阴性宫颈癌细胞C33A细胞中miR-29的表达与HPV16阳性宫颈癌细胞SiHa/CaSki中的表达无明显差异；与对照组U20S细胞相比,表达HPV16 E6的骨肉瘤细胞U2OSE6中miR-29的表达无显著差异；C33A中转染HPV16 E6/E7表达质粒,不引起miR-29的表达改变。4.体内HPV感染宫颈组织和体外HPV感染筏式培养组织中,miR-224在HPV感染过程中呈双向表达特征；体外细胞中调控HPV E6/E7表达不能直接引起miR-224的表达变化；体外细胞中调控miR-224不能直接引起HPV E6/E7的表达变化。结论1.miR-29通过直接靶向调控YY1、CDK6调控细胞周期和凋亡的改变,促进了HPV诱导的细胞恶性转化过程,从而参与了宫颈癌的发生,提示miR-29可能是宫颈癌相关的抑癌miRNA, YY1、CDK6可能是宫颈癌相关的癌基因。2.miR-224的表达在宫颈癌癌变过程中存在特征性双向变化,但不受HPV病毒基因E6/E7的直接调控。