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研究背景肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC,简称肝癌)是全球第五大常见恶性肿瘤,占与肿瘤有关的死因的第3位。每年约有782500例新发肝癌患者,约745500例肝癌患者死亡。其中大约一半的新发病例及死亡病例发生在中国。大部分患者确诊时已属中晚期,只有约30%的肝细胞癌患者有机会接受外科切除手术。此时,肝动脉化疗栓塞术(transarterial chemoembolization, TACE)是此类患者最主要的局部治疗选择。目前我国应用TACE治疗的患者比例占到总肝癌患者人数的61.9%,是中晚期肝癌患者最主要的治疗方式。TACE的近期疗效虽然肯定,既可以很好控制症状又可以局部控制病灶,但多项研究显示TACE远期疗效并不理想,术后组织高达90%的残留率、术后缺氧环境的形成以及因缺氧而导致肿瘤新生血管的形成均极大的增加了肝癌复发、转移的机率,从而影响患者的总生存期。因此,基于TACE术后的缺氧环境,探索敏感且特异的肿瘤标记物用于判断TACE疗效和预测肿瘤复发转移对优化TACE的临床应用、寻找最佳适合患者人群、提高远期疗效意义重大。近年来,微小RNA(microRNA,简称miRNA)的出现为肿瘤的早期诊断及疗效预后的判断提供了新的思路。miRNA是一类长度约19-25个核苷酸的非编码单链小分子RNA,通过与mRNA的3’端非编码区(3’untranslated region, 3’UTR)结合而介导转录后调控,在细胞的增殖、分化、凋亡、个体的发育以及疾病的发生发展中发挥着重要的作用,具有高度保守性和内源性。近年众多研究显示血清或血浆中存在大量稳定的miRNA,可以作为许多疾病潜在的分子标志物。血液中的miRNA存在于大量细胞释放出来的囊泡当中,其表达量与细胞中的miRNA表达量呈正相关。相关研究发现血清中存在稳定表达的miRNA,可耐受RNA酶、酸碱和温度的变化。总的来说,肿瘤组织中高表达的miRNA能释放入外周血中,且外周血中miRNA同样存在高表达还具有一定的稳定性及特异性,使得miRNA可作为一种非侵袭性的肿瘤标记物。事实上,已有相当研究表明血清中miRNA可作为肝癌诊断的潜在的分子标记物。本研究创新性的将肝癌中特异性变化的miRNA miR-199a/b-3p与中晚期肝癌最常用的治疗方式(TACE)结合起来,从血清水平去探索肝癌患者miR-199a/b-3p的表达规律、探索TACE对miR-199a/b-3p表达水平的影响和血清miR-199a/b-3p变化规律同TACE术后近期疗效之间的关系,以探究血清miR-199a/b-3p是否有作为理想的肿瘤标志物的潜力。对TACE术后疗效反应的早期预测,有利于肝癌患者的个体化治疗,延长患者生存期。目的探索血清miR-199a/b-3p与肝细胞癌患者TACE术后近期疗效之间的关系,探究其作为肝细胞癌TACE术疗效预测的分子标志物的潜力。材料与方法本研究的患者分为2组,其中实验组来自2014年3月至2014年10月就诊于我院并经临床或病理确诊的肝癌患者共132例。年龄为57.1±10.3(38-72)岁,男性患者约占80%。肿瘤平均大小7.1cm(2.2-15.7cm)。81例(61%)患者肿瘤数目大于1个。AFP大于400ng/mL的肝癌患者占48%,Child-Pugh A级患者有102例(77%),B级30例(23%)。根据BCLC分期,BCLC A期患者36例(27%),B期患者60例(46%),C期患者36例(27%)。实验组纳入标准包括：(1)临床确诊或病理确诊为肝细胞癌(临床诊断标准：AFP≥400ng/ml,一种影像学提示肝内占位性病变；或AFP<400ng/ml,两种影像学提示肝内占位性病变)；(2)年龄大于18周岁；肝功能Child-Pugh分级A或B级(表1-1)；ECOG评分为0-1分(表1-2)；BCLC分期A-C期(表1-3)；(3)根据实体肿瘤评估mRECIST(modified response evaluation ciriteriain solid tumor guideline)标准,至少有1个可测量未处理的靶病灶；(4)首次治疗方式为TACE;(5)无合并心、肺、肾功能不全者。对照组共50例,其中25例无乙肝及肝硬化的正常人来自我院体检中心,余25例乙肝后肝硬化患者来自我科门脉高压症患者。实验组与对照组两组间性别及年龄相匹配。TACE术中将导管插管至肿瘤供血动脉,将化疗药物(奥沙利铂50-100mg、表柔比星10-20mg、丝裂霉素10-20mg)与碘油混合制成化疗栓塞乳剂经导管注入,并用PVA颗粒或明胶海绵栓塞肿瘤供血动脉。实验组肝癌患者抽血分四个时间点：PACE术前(t1)、术后3-5天(t2)、术后四周第二次TACE术前(t3)及第二次TACE术后3-5天(t4)。实验组与对照组均在清晨空腹时抽取外周血4ml。应用实时荧光定量PCR方法检测所有标本中miR-199a/b-3p的表达水平。T2相对t1时间点血清miR-199a/b-3p变化幅度定义为：Change in miRNA-199a/b-3pt1-t2= Serum miR-199a/b-3p levels at t2-serum miR-199a/b-3p levels at t1 Serum miR-199a/b-3p levels at t1首次TACE治疗术后4周行增强CT或MRI明确肿瘤病灶控制情况。TACE术后肿瘤病灶控制情况及疗效采用改良实体瘤疗效评价标准(mRECIST标准)进行评估。CR及PR的患者定义为TACE疗效反应好组(A组：responder group);将SD和PD的患者定义为TACE疗效反应差组(B组：no responder group)。并收集所有患者以下临床病理资料：年龄、性别、乙肝表面抗原、肝硬化、肿瘤大小、甲胎蛋白、肿瘤数目、门静脉癌栓、child-pugh分级、BCLC分期。重点研究肝细胞癌患者血清miR-199a/b-3p表达水平同其相关的临床病理因素、不同时间点血清miR-199a/b-3p的变化规律及其同TACE疗效反应的情况。采用GraphPad Prism software (SanDiego, CA, USA)进行统计学分析,所有计量资料均以x±s表示。对实验数据先行正态分布检验：若符合正态分布,考虑应用两样本t检验比较患者和正常人血清miRNAs的表达差异；若不符合正态分布,采用两独立样本的秩和检验。用卡方检验分析miR-199a/b-3p表达水平高低两组与患者临床病理参数间的关系、TACE疗效反应与血清miR-199a/b-3p变化情况的关系。P<0.05时,认为差异有统计学意义,统计检验选择双侧概率检验。结果1、治疗结果132例肝细胞癌患者行TACE治疗,其中126例在首次TACE术后4周返院行第二次TACE治疗,余6例患者失访,未返院行进一步检查及治疗。根据mRECIST标准评估,首次TACE术后4周肿瘤缓解程度有15例达到CR,35例达到PR,62例维持SD,14例出现PD。共有50例CR+PR患者判断为TACE疗效反应好组(A组：responder group),共有76例SD+PD患者评价为TACE疗效反应差组(B组：io responder group)。2、 实验组与对照组血清miR-199a/b-3p表达量的对比相比对照组,肝癌患者血清中miR-199a/b-3p的表达量显著降低,差异有统计学意义(0.68±0.81 vs 2.50±2.16,P<0.001)。实验组肝癌患者血清miR-199a/b-3p的中位表达量为0.267。3、血清miR-199a/b-3p表达水平与患者临床病理参数之间的关系肝癌患者血清miR-199a/b-3p的表达差异(以中位表达量为界分为高表达组与低表达组,各66例)与肿瘤大小呈负相关(P<0.001),而与年龄、性别、乙肝病毒表面抗原、Child-Pugh分级、血管侵犯、BCLC分期、肝硬化、肿瘤数目、甲胎蛋白等因素无明显相关性。4、血清miR-199a/b-3p在不同时间点的表达水平与TACE疗效的关系结果显示A组在t1时miR-199a/b-3p的表达量显著高于B组(1.96±1.32 vs0.77±1.09),miR-199a/b-3p的表达量与TACE的疗效反应呈正相关,差异具有统计学意义(P<0.001),而t2、t3、t4时间点miR-199a/b-3p的表达量与TACE疗效反应无统计学差异。5、miR-199a/b-3pt1-t2变化幅度与TACE疗效的关系进一步分析显示在A组t2相对t1的血清miR-199a/b-3p变化幅度大于B组,差异有统计学意义(P=0.011)。A组中下降幅度大于25%的比例大于B组(64%vs 39%)。在A组t3、t4时间点相对t1的血清miR-199a/b-3p变化幅度与B组相比差异没有统计学意义。结论血清miR-199a/b-3p有作为肝癌TACE术后疗效早期预测的生物标记物的潜力。肝癌患者血清miR-199a/b-3p表达水平显著下调,其表达水平与肿瘤大小呈负相关。肝癌患者血清miRNA-199a/b-3p表达水平与TACE疗效反应呈正相关,即miRNA-199a/b-3p表达水平高,TACE术后疗效反应好。[ACE术后3-5天miR-199a/b-3p降低的幅度同术后疗效呈正相关,即术后血清miRNA-199a/b-3p下降幅度大的术后疗效较好。