原发性肝癌是危害人类生命安全的重要疾病。肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是最普遍的原发性肝癌,其5年的生存期只有18%。药物治疗为最常用的HCC治疗方式。然而,由于肿瘤生长过程复杂,FDA批准的一线药物治疗方案仍然难以满足需求。因此,探索新的有效策略实现高效的药物递送从而提高HCC治疗效果是目前研究的热点。光热疗法（Photothermaltherapy,PTT）是目前肿瘤治疗领域中研究的热点,不仅杀伤肿瘤,同时诱发免疫原性细胞死亡（Immunogeniccelldeath,ICD）效应激活机体免疫应答,使其在肿瘤治疗方面具有独特的优势。然而,单独PTT肿瘤治疗效果有限。一方面,PTT常用近红外一区（NIR-I,650-950 nm）光热剂,由于其易被皮肤组织吸收和散射,穿透深度受限,光热效应较弱,导致肿瘤消除不完全,不适用于深层组织肿瘤。而近红外二区（NIR-Ⅱ,1000-1350nm）光,由于波长较长,具有更高的组织穿透能力和最大允许辐照量,可用于深层次肿瘤。因此,NIR-Ⅱ区PTT可以在提高穿透深度的同时增强光热效应,适用于深层组织肿瘤,具有更好的临床应用潜力。然而,目前可应用于NIR-Ⅱ区PTT治疗的光热材料仍较为有限。黑磷（Blackphosphorus,BP）是一种备受关注的新型二维纳米材料,具有良好的安全性、生物相容性、高载药量和NIR-Ⅱ区高光热转化效率等优势,在药物载体和光热治疗领域拥有广阔的应用前景。因此,本课题采用BP作为NIR-Ⅱ光热治疗剂,不仅可以促进肿瘤渗透深度,同时可以增加光热治疗效果。另一方面,PTT通过ICD效应激活机体免疫应答的过程会受到肿瘤免疫抑制微环境的影响,使得PTT在免疫方面的疗效受限。免疫检查点阻断T细胞发挥作用和高表达PD-L1的巨噬细胞上抑制CD8+T细胞的活性是HCC免疫抑制的两个主要因素。因此,采用有效的联合策略缓解肿瘤免疫抑制微环境,将进一步提高PTT诱导ICD的免疫治疗效果。化疗药物索拉非尼（Sorafenib,SF）和免疫检查点抑制剂PD-L1抗体是一种很有效的联合策略,目前处于临床实验阶段（NCT04770896）。PD-L1抗体抑制PD-1/PD-L1通路,增强T细胞免疫杀伤能力,缓解HCC免疫抑制微环境。SF发挥化疗杀伤效果。此外,已有研究表明SF抑制RAF-MEK-EPK的通路能够下调PD-L1表达。本课题巧妙利用SF阻断RAF-MEK-EPK通路的机制,下调肿瘤细胞和TAM细胞上PD-L1的表达,进一步激活T细胞,从而逆转HCC微环境免疫抑制的状态。因此,将化疗药物SF和PD-L1抗体联用,有效调控肿瘤免疫抑制微环境,增强PTT诱导的ICD治疗效果。然而,多种不同的药物共递送至肿瘤部位面临较大挑战,因此选择一种合适的递送策略至关重要。纳米药物递送系统为多种药物共递送提供了良好的解决策略。其中,基于治疗性载体的“Carrier-free”药物递送系统因具有载药量高、生物相容性好、低细胞毒性等优点引起广泛关注。BP纳米片由于褶皱的晶格结构从而具有高比表面积,用于抗肿瘤药物的装载,是一种极具潜力的“Carrier-free”药物递送系统”。因此,本课题选择BP纳米片作为NIR-Ⅱ区光敏剂和药物载体构建基于BP的“Carrier-free”药物递送系统,不仅发挥优异的PTT能力;同时作为药物载体有效包载SF和PD-L1抗体,充分提高递送效率,发挥联合治疗效果。基于上述设计理念,本课题以BP纳米片（BP nanosheet,BPNSs）为药物载体和光敏剂,设计共载SF和PD-L1抗体的“Carrier-free”药物递送系统（BPSP）。本文首先利用超声破碎法制备合适粒径的BPNSs,考虑到BPNSs在空气中极易氧化,利用氨基化合物Mal-PEG-NH2功能化修饰BPNSs,制备BP@PEG-Mal。接着利用BPNSs上巨大的比表面积,在BP@PEG-Mal上首次装载SF,制备BP@PEG-Mal/SF。最后将巯基化的PD-L1抗体与BP@PEG-Mal/SF在通过迈克尔加成反应制备BP@PEG/SF-PD-L1（BPSP）。BPSP通过PD-L1介导的主动靶向共递送SF和PD-L1单抗到达HCC部位后,采用NIR-Ⅱ区激光照射HCC部位,HCC部位温度迅速升高,产生相应的治疗效果。具体包括:①NIR-Ⅱ光热治疗杀伤肿瘤,为免疫反应的发生减轻负担;同时诱导ICD效应,激活机体免疫应答;②对HCC进行局部加热可以部分破坏深层HCC细胞间质,减少Ⅰ型胶原蛋白,促进SF和PD-L1深层渗透;③促使BPNSs上SF和PD-L1抗体快速扩散以不同机制杀死肿瘤细胞,同时解除T细胞免疫抑制,缓解HCC部位免疫抑制的微环境,增强ICD疗效。本课题主要研究内容如下:1.索拉非尼含量测定方法学建立通过高效液相色谱法建立索拉非尼含量测定的方法学,对该方法线性关系进行评价。2.共载SF和PD-L1多功能黑磷纳米片的制备及评价通过分析BPSP载药量、形态、电位和粒径、厚度、X射线光电子能谱、拉曼光谱,评价其理化性质;通过紫外吸收曲线考察了 BPSP的体外稳定性;通过NIR-Ⅱ激光器和温度计考察BPSP的光热性能;通过透析法考察了 BPSP的体外释放能力;采用MTT法检测BPSP对Hepa 1-6细胞的体外细胞毒性;采用细胞摄取和近红外小动物成像结果评价BPFP体内外肿瘤靶向能力。3.共载SF和PD-L1多功能黑磷纳米片联用机制评价评价NIR-Ⅱ激光促进BPSP深层渗透研究能力,首先采用不同厚度的猪皮覆盖在肿瘤表面,评价NIR-Ⅱ激光照射下BPSP穿透的深度;接着通过构建肿瘤球评价BPCP+L组的体外深层渗透性能力;然后通过激光共聚焦显微镜进一步考察BPCP的体内渗透能力;最后通过免疫荧光切片观察了 NIR-Ⅱ激光照射下Collagen Ⅰ的表达情况。通过检测CRT、HMGB1、ATP、DC成熟来评价BPSP诱导ICD效应的能力。通过流式实验评价了 BPSP与PD-L1表达的关系。4.共载SF和PD-L1多功能黑磷纳米片体内药效学评价本论文选择荷Hepa1-6的C57BL/6移植瘤小鼠为模型,验证BPSP在NIR-Ⅱ激光照射下用于HCC体内联合治疗效果,考察其在皮下瘤体内的抗肿瘤效果;在皮下瘤的基础上,通过手术建立了 HCC原位模型考察BPSP+L组原位抑瘤效果。通过流式细胞术和ELISA试剂盒分别考察体内免疫微环境的相关细胞,包括（T细胞、CTL细胞和Tregs）的数量,细胞因子水平包括（INF-γ、IL-12、TNF-α等）进行考察来评价BPSP在NIR-Ⅱ激光照射下光热疗效的免疫逆转作用。此外,通过溶血实验和小鼠主要器官H＆E染色对其进行安全性评估。综上所述,本文从提高光渗透深度和增强PTT诱导的ICD效应两方面增强HCC联合治疗效果,以BPNSs为药物载体和光敏剂,构建共载SF和PD-L1抗体的“Carrier-free”纳米递送系统（BPSP）,在 HCC 皮下瘤和原位模型上展现了 良好的抗肿瘤治疗效果。这是一种创新性的肿瘤联合治疗方法,希望为肿瘤治疗开辟了新的治疗方案,为其他各种肿瘤提供借鉴和参考。