论文部分内容阅读
第一部分人热休克蛋白70腺病毒载体的构建目的构建人热休克蛋白70(HSP70)重组腺病毒(AD)载体(AD5-HSP70)。方法通过质粒提取、测序鉴定HSP70,利用细菌内质粒间同源重组法构建AD5-HSP70。结果成功获取HSP70后,利用细菌内质粒间同源重组法成功复制缺陷重组腺病毒载体AD5-HSP70。结论本研究证实利用细菌内同源重组法成功构建腺病毒载体AD5-HSP70并通过测序,为进一步研究HSP70的基因治疗奠定了基础。第二部分改良Heron法建立颈部异位心脏移植模型目的对Heron法进行部分改进,建立简化的wistar—SD大鼠颈部异位心脏移植模型。方法采用改进的套管技术通过自制Cuff管将wistar大鼠供心的升主动脉、肺动脉与SD大鼠受体的右侧颈总动脉、颈外静脉分别进行吻合连接。结果单人操作连续进行正式试验24例,成功率100%,无吻合口漏血或血管回流受阻,移植物复跳率100%。总手术时间45~60min,吻合时间3~5min,供心冷缺血平均15min。结论改良Heron法建立大鼠颈部异种心脏移植无需显微外科操作,是一种简便、经济实用、稳定可靠和易于复制的器官移植研究动物模型。第三部分转染人热休克蛋白70对同种异体移植心脏移植物血管病的影响目的建立颈部心脏移植模型,研究经冠状动脉内灌注重组腺病毒载体介导HSP70(Ad.HSP70)转基因治疗对同种异体心脏移植物血管病的影响,并探讨同种移植的基因转移技术。方法以套管技术建立颈部异位异种心脏移植模型,wistar大鼠供心切取后,基因转移组在体外经冠状动脉缓慢灌注含3.8×1010 VP/mL Ad-HSP70的4℃HTK液,持续45min,再植入SD大鼠受体颈部(3组)。空白载体组灌注含3.8×1010 VP/mL不携带的基因腺病毒空白载体(Ad)的HTK液(2组),对照组仅灌注无病毒的HTK液(1组)持续同样时间。术后1月收集移植物组织作检测。组织内目的基因表达产物通过免疫分析、RT-PCR进行半定量分析,免疫组化染色进行定性和定位分析。结果RT-PCR证实移植物内外源性HSP70基因转录,免疫组化检测证实Ad-HSP70转染的移植物(3组)HSP70成功转到血管周围的心肌细胞和冠状动脉微血管,HSP70表达水平明显高于其他两组(P<0.01)。HSP70过量表达能够增加BCL-2表达及减少NF-κB的活化以及VCAM-1的表达,HSP70过量表达的移植物内炎症细胞浸润数明显减少,巨噬细胞和NK细胞浸润减少,移植物血管内皮损伤轻。结论本研究证实,经冠状动脉灌注重组腺病毒载体介导保护性自稳蛋白—人热休克蛋白70基因转移到心脏移植物是相当有效可行的,并减轻移植物冠脉内皮损伤,预防移植物血管病。经冠状动脉灌注重组腺病毒载体介导基因转移在移植物内局部表达有潜力的治疗制剂,此方法具有广阔的临床应用前景。