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菲牛蛭Poecilobdella manillensis Lesson,别名为马尼拉医蛭,是环节动物门蛭纲无吻蛭目医蛭科牛蛭属动物,药材名金边蚂蟥。具有破血通经,逐瘀消癥之功效。以吸食脊椎动物鲜血为生,其唾液腺分泌物中含有抗凝、抗栓、抗炎、麻醉等活性成分。在吸食期间,吸血蛭通过将大量生物活性物质转移到寄主体内,阻止伤口过早的止血和血液凝固,促使吸血蛭顺利吸食血液,目前对于吸血蛭的研究主要集中在活性物质的挖掘及药理作用方面,而吸血蛭吸食阶段抗凝活性的变化及吸食相关基因表达模式方面的研究较少。本研究从菲牛蛭药材采收加工、吸食阶段各组织抗凝血酶活性及吸食相关基因表达的变化规律等方面入手,为科学地进行药材采收加工和吸食相关基因表达模式提供理论依据。主要研究结果如下:(1)在菲牛蛭药材采收及不同加工方法中,采用凝血酶滴定法对不同加工方法、不同采收部位和体重等级样品进行抗凝血酶活性测定。结果表明,在不同加工方法对菲牛蛭抗凝血酶活性影响试验中,菲牛蛭鲜品经冷冻干燥处理后其抗凝血酶活性最高,达到1303.56 U·g-1,而90 ℃烘干样品最低,为15.44 U·g-1;在不同采收部位抗凝血酶活性比较试验中,菲牛蛭头部的抗凝血酶活性最高,为226.42 U·g-1,尾部仅为102.12 Uˉg-1;在不同体重等级对菲牛蛭抗凝血酶活性影响试验中,菲牛蛭体质量≤10g时,抗凝血酶活性最高,为328.86U·g-1,体质量为≥40g时,抗凝血酶活性最低,为87.71 U·g-1。采收及不同加工方法对菲牛蛭抗凝血酶活性均有显著性影响。菲牛蛭头部抗凝活性最高,在菲牛蛭采收加工中应该选取体重范围在20～30 g的菲牛蛭,优先选用超低温冷冻干燥方法进行干燥,其次选用晒干方法进行干燥。(2)分别解剖不同吸食阶段中菲牛蛭的六个组织,采用凝血酶直接滴定法分别对各处理样品进行抗凝血酶活性测定。结果表明,菲牛蛭唾液腺和前吸盘中抗凝血酶活性显著高于其他组织(P<0.05),吸食后菲牛蛭各组织抗凝血酶活性的变化存在显著差异(P<0.05)。(3)根据菲牛蛭转录组序列设计引物,通过RT-PCR技术从菲牛蛭唾液腺中扩增出目的基因片段,连接、转化、挑取阳性克隆测序并拼接;采用基于内参基因的相对定量PCR方法,分析基因表达量特征。结果得到全长371 bp的菲牛蛭Eglin C(PME)基因,最大开放阅读框是264bp,编码87个氨基酸。NCBI上进行Blast比对,菲牛蛭PME基因与其它蛭类的Eglin基因同源性都在60%以上,并在系统进化树中与医蛭科蛭类聚为一类。PME基因表达存在空间差异性,吸食前后,菲牛蛭组织中PME基因的相对表达量存在显著性差异(P<0.05)。(4)根据菲牛蛭转录组序列设计引物,通过RT-PCR技术从菲牛蛭唾液腺中扩增出目的基因片段,连接、转化、挑取阳性克隆测序并拼接;采用基于内参基因的相对定量PCR方法,分析基因表达量特征。结果得到全长298 bp的菲牛蛭Guamerin(PMG1)基因和全长281bp的菲牛蛭Guamerin 2(PMG2)基因,最大开放阅读框分别为186 bp和204 bp,分别编码61个氨基酸和67个氨基酸。NCBI上进行Blast比对,菲牛垤PMG1和PMG2基因与医蛭科其他蛭类Guamerin基因编码氨基酸序列同源性都在60%以上,并在系统进化树中与医蛭科蛭类聚为一类。PMG1、PMG2基因表达存在空间差异性,吸食前后,菲牛蛭组织中PMG1、PMG2基因的相对表达量存在显著性差异(P<0.05)。