中风目前在全世界成人死因排序中位于第二位,是长期残疾的主要病因。由于脑中风所带来的巨大的社会经济负担,针对该疾病发病机制和治疗策略的基础和临床研究越来越成为医学研究的热点。脑中风可分为两大类:出血性中风和缺血性中风。缺血性中风大约占70~80%,由于血栓阻塞脑血管(通常是大脑中动脉或其分支)所致,大脑供应动脉受阻后,血流急剧下降,局部脑组织发生脑缺血缺氧损伤。缺血诱导的缺血性脑损伤取决于缺血脑动脉血流量的多少以及脑缺血的持续时间,脑血流量越小,持续时间越长,脑损伤越严重。缺血性脑损伤涉及一系列复杂的病理生理机制,包括兴奋性中毒、离子稳态破坏、梗死周边去极化、氧自由基损伤、炎症反应、血脑屏障破坏以及细胞凋亡等机制,这些病理生理机制呈现一个时间、空间改变的动态过程。脑缺血损伤从病程上可分为三个连续的阶段:急性期(分钟~小时),亚急性期(小时~天)和慢性期(天~月)。根据供应动脉的分布,可将脑缺血的局部脑组织分为缺血中心区和缺血周边区。脑血流量在缺血中心区急剧下降(梗死核心),缺血周边区的脑血流量也有不同程度的降低,离中心区越远脑血流量的降低越不明显。在脑梗死中心,神经元坏死在数分钟内发生;而在缺血半暗带,因为侧枝血管可部分补偿脑血流量的不足,所以缺血的严重程度和再灌注的时间窗决定了半暗带区残存神经元的预后。缺血性脑损伤潜在的治疗策略主要包括两大类:溶栓治疗和神经保护治疗。溶栓治疗在急性缺血性中风超早期(即3小时时间窗内)治疗可能有效。由于其有效地治疗时间窗太窄,大约只有1.0~8.5%的患者有机会接受溶栓治疗。在缺血性脑中风动物模型中,针对各种病理损伤机制的神经保护措施已经得到广泛的探索。本实验研究脑缺血预处理对大鼠持续性脑缺血损伤模型的神经保护作用,然后在此基础上进一步探讨脑缺血预处理减轻大鼠缺血性脑损伤的可能机制。第一部分:探讨多种脑缺血预处理方案从而获取减轻大鼠缺血性脑损伤的最佳方案目的:探讨多种脑缺血预处理方案从而获取减轻大鼠缺血性脑损伤的最佳方案。方法:以成年雄性SD大鼠为研究对象,以短暂夹闭双侧颈总动脉为基本方法,建立多种短暂性脑缺血预处理方案,预处理方案包括5组:假缺血预处理组、缺血5min(1×5)组、缺血2次5min(2×5)组、缺血3次5min(3×5)组以及缺血15min(1×15)组,多次缺血预处理组的间隔时间均为15min,每组6只SD大鼠。72h后,行脑切片TTC染色和HE染色,观察单纯缺血预处理对脑组织的损伤情况。另外再设立5组实验,每组6只SD大鼠,各组先建立缺血预处理不同方案,48h后制备大鼠右侧大脑中动脉栓塞模型,成功建立动物模型24h后,检测大鼠神经功能损伤评分以及脑梗死体积。结果:缺血预处理1×15组和3×5组大鼠脑额顶叶皮质及相应的皮质下结构可见神经元损伤,而在其他三组未见明显的神经元损伤。除了假缺血预处理组,四种缺血预处理方案均能减轻大脑中动脉栓塞所致的脑梗死体积,其中,缺血预处理2×5组最大程度地减轻脑梗死体积。结论:实验结果显示,短暂性脑缺血预处理对大鼠持续性脑缺血具有神经保护作用。其中,缺血预处理2×5方案可能是本实验设计四种方案中的最佳方案。第二部分:缺血预处理通过PI3-K/Akt和ERK1/2信号通路减轻大鼠缺血性脑损伤目的:研究大鼠持续性脑缺血的病理改变以及不同缺血时间Akt和ERK1/2信号的表达特点;研究缺血预处理是否通过PI3-K/Akt和ERK1/2信号通路减轻大鼠缺血性脑损伤。方法:以成年雄性SD大鼠为研究对象,建立大鼠pMCAO模型,设立假手术对照组,在脑缺血后6、12、24、48、72h检测大鼠神经功能损伤评分、测量脑梗死体积、观察大脑形态学特点,免疫组织化学法和western blot法检测p-Akt、p-ERK1/2、t-Akt、t-ERK1/2的表达特点。另外再设计6组实验,每组6只SD大鼠,给予脑室内注射LY294002(选择性Akt抑制剂)或PD98059(选择性ERK1/2抑制剂),并给予缺血预处理2×5方案,再灌注48h后制备pMCAO模型,持续性脑缺血24h后检测大鼠神经功能损伤评分和脑梗死体积,同时通过western blot法检测缺血脑组织p-Akt、p-ERK1/2、t-Akt、t-ERK1/2的蛋白表达水平。结果:大鼠持续性脑缺血后,缺血脑组织形态学可见神经损伤、坏死,缺血脑皮质被分成梗死核心和梗死周边区两部分;神经功能损伤评分以及脑梗死体积显著增高,且24h达到高峰;p-Akt于6-12h表达增高,24-72h表达明显降低,p-ERK1/2于6h表达增高,12-72h表达降低,t-Akt和t-ERK1/2表达不变。缺血预处理减轻大鼠脑梗死体积,这一作用被LY294002或PD98059或二者混合物抑制。脑缺血诱导的p-Akt和p-ERK1/2低表达可被缺血预处理激活,这一作用也被LY294002或PD98059或二者混合物抑制。结论:结果显示,Akt和ERK1/2信号在脑缺血早期被激活,晚期被抑制;此外,缺血预处理通过PI3-K/Akt和ERK1/2信号通路减轻大鼠缺血性脑损伤。第三部分:通过PI3-K/Akt和ERK1/2信号通路抑制炎症反应可能是缺血预处理减轻缺血性脑损伤的机制之一目的:探讨大鼠持续性脑缺血后炎症反应在脑组织中的分布以及炎症介质的表达水平;并进一步探讨缺血预处理是否通过PI3-K/Akt和ERK1/2信号通路抑制炎症反应,从而减轻缺血性脑损伤。方法:先设置第一大组,建立SD大鼠pMCAO模型,设立假手术对照组,在脑缺血后6、12、24、48、72h后检测髓过氧物酶(MPO)的表达分布以及缺血脑组织中的MPO含量,然后通过western blot进一步检测缺血脑组织促炎症因子NF-κB和COX-2的表达水平,用ELISA法检测大鼠血清TNF-α的含量。另外再设计六组实验,给予脑室内注射LY294002(选择性Akt抑制剂)或PD98059(选择性ERK1/2抑制剂),并给予缺血预处理2×5方案,再灌注48h后制备pMCAO模型,检测缺血脑组织中MPO、NF-κB和COX-2的表达水平,检测血清TNF-α的含量。结果:炎症标志物MPO表达于脑梗死区,以缺血核心区为主,MPO含量从脑缺血后6h开始增高,24h达到高峰,随后降低,但仍高于正常水平。NF-κB、COX-2和TNF-α的表达也于脑缺血后6h开始增高,NF-κB和COX-2分别于24h和12h达到高峰,并且于72h内持续高表达,TNF-α于12h达到高峰,48-72h降至正常水平。缺血预处理明显降低脑缺血后的炎症反应以及促炎症因子的表达水平,但缺血预处理的这一作用被LY294002或PD98059抑制。结论:持续性脑缺血诱导局部炎症反应和促炎症因子的表达;缺血预处理通过PI3-K/Akt和ERK1/2信号通路抑制炎症介质的表达和炎症反应,这可能是缺血预处理减轻缺血性脑损伤的机制之一。第四部分:通过PI3-K/Akt和ERK1/2信号通路抑制神经元凋亡可能是缺血预处理减轻缺血性脑损伤的机制之一目的:探讨大鼠持续性脑缺血后神经元凋亡在缺血脑组织中的时空分布特点,以及线粒体细胞色素c释放入细胞浆、caspase-3激活的特点;并在此基础上进一步探讨缺血预处理是否通过PI3-K/Akt和ERK1/2信号通路抑制神经元凋亡,从而减轻缺血性脑损伤。方法:先设置第一大组,建立SD大鼠pMCAO模型,设立假手术对照组,在脑缺血后6、12、24、48、72h,用TUNEL染色法检测神经元凋亡的时空分布,然后通过western blot进一步检测线粒体细胞色素c、胞浆细胞色素c、pro-caspase-3的表达水平。另外再设计六组实验,给予脑室内注射LY294002(选择性Akt抑制剂)或PD98059(选择性ERK1/2抑制剂),并给予缺血预处理2×5方案,再灌注48h后制备pMCAO模型,检测缺血脑组织中神经元凋亡的变化、以及线粒体细胞色素c、胞浆细胞色素c、pro-caspase-3的表达水平。结果:大鼠持续性脑缺血后,缺血脑组织发生神经元凋亡,主要位于缺血周边区,脑缺血72h神经元凋亡达到高峰。脑缺血后24-72h,线粒体细胞色素c的表达水平下降,细胞浆细胞色素c的表达水平升高,pro-caspase-3的表达水平下降。缺血预处理抑制神经元凋亡、上调线粒体细胞色素c的表达、下调胞浆细胞色素c的表达、升高pro-caspase-3的表达,缺血预处理的这一系列作用被LY294002或PD98059抑制。结论:持续性脑缺血诱导缺血脑组织神经元凋亡、细胞色素c的释放以及caspase-3的激活;缺血预处理通过PI3-K/Akt和ERK1/2信号通路抑制细胞色素c的释放、caspase-3的激活和神经元凋亡,这可能是缺血预处理减轻缺血性脑损伤的机制之一。