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创伤性脑损伤（traumatic brain injury,TBI）是一种高死亡率和致残率的中枢神经系统疾病。TBI分为两个阶段,即原发性脑损伤和继发性脑损伤。相较于原发性脑损伤,继发性脑损伤广泛多样,在TBI的病理发展中扮演着重要角色。过量自由基诱发的继发性脑损伤是TBI病情恶化的重要原因之一。以氧化应激和神经炎症为靶点的水凝胶对TBI的修复有重要作用。在本研究中,天然抗氧化剂没食子酸改性的透明质酸（gallic acid-hyaluronic acid,HGA）大分子被引入到酪胺基透明质酸（tyramine-hyaluronic acid,HT）中,以构建一种新型、可原位注射、抗氧化水凝胶,与HT水凝胶相比,HT/HGA水凝胶对DPPH和羟基自由基的清除能力显著增强（P＜0.05）,而且对H2O2诱导的细胞氧化损伤具有显著改善的保护作用（P＜0.05）,并减少细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）积累。中度TBI小鼠模型研究结果显示,HT/HGA水凝胶原位移植可通过激活Nrf2/HO-1通路抑制氧化应激,促进M2表型小胶质细胞的极化并调节炎症反应,从而改善损伤部位恶劣的微环境,改善TBI小鼠的运动、学习及记忆功能。目的本课题拟以GalOx和HRP为交联剂,交联HT及HGA高分子,制备抗氧化及可注射型HT/HGA水凝胶,并进行物理化学性质表征,随后在动物水平和分子水平上系统研究HT/HGA水凝胶对TBI小鼠神经修复的作用及潜在的分子机制。方法第一部分:HT/HGA水凝胶的制备及性能表征基于EDC/NHS偶联法合成HT和HGA聚合物,并利用核磁共振氢谱仪和紫外-可见分光光度计检测酪胺（tyramine,Tyr）和没食子酸（gallic acid,GA）是否接枝成功及接枝率;然后制备不同含量的HGA水凝胶(HT0.5、HT0.5HGA0.25、HT0.5HGA0.5、HT0.5HGA0.75);通过扫描电子显微镜（scanning electron microscope,SEM）和旋转流变仪检测水凝胶的微观结构和机械性能,并测定水凝胶的成胶时间、含水率和降解率;使用DPPH法和番红O褪色法测定水凝胶的抗氧化性能;通过CCK-8实验和活性氧ROS荧光探针（2,7-Dichlorodi-hydrofluorescein diacetate,DCFH-DA）检测水凝胶对氧化损伤细胞的保护作用;通过CCK-8实验、溶血实验和皮下注射实验检测水凝胶的细胞相容性、血液相容性及组织相容性。第二部分:HT/HGA水凝胶移植对TBI小鼠神经修复作用的研究利用改进的Feeney自由落体法建立C57小鼠中度TBI模型,然后进行原位移植治疗,小鼠分为Sham组（只开窗未造模）、NS组（造模后注射生理盐水）、HT组和HT/HGA治疗组（造模后原位移植水凝胶）。治疗3天后通过伊文思蓝染色观察小鼠血脑屏障（blood-brain barrier,BBB）的完整性并通过蛋白质免疫印迹（Western Blot,WB）实验检测Nrf2/HO-1信号通路相关蛋白的表达;在治疗的第1、3、7、14和21天通过神经功能缺损评分（modified neurological severity score,m NSS）检测小鼠运动功能的恢复;治疗的第16-21天通过Morris水迷宫实验（Morris water maze,MWM）和糖水偏好实验（sucrose preference test,SPT）评估小鼠认知能力的恢复和抑郁情绪的改善;治疗3天和21天后通过测定还原型谷胱甘肽（glutathione,GSH）和丙二醛（malondialdehyde,MDA）的含量评价小鼠病灶区的氧化应激程度;治疗21天后通过WB实验检测炎症相关因子（TNF-α、IL-6、IL-4）、凋亡相关蛋白（Bax、Bcl-2）和神经元特异性相关蛋白（β-Ⅲtublin、NFL、NSE、NeuN）的表达,并通过免疫荧光实验检测小鼠病灶区Arg1（小胶质细胞M2型标记物）和iNOS（小胶质细胞M1型标记物）的表达以及海马DG区NeuN（神经元标记物）和Ki67（细胞增殖标记物）的表达。结果第一部分:HT/HGA水凝胶的制备及性能表征1、HT和HGA聚合物的核磁共振氢谱（~1H NMR）和紫外-可见吸收光谱（UV-vis）都出现了Tyr和GA的特征峰,表明Tyr和GA接枝成功;通过标准曲线计算得到,Tyr的接枝量为44.37μmol/g,GA的接枝量为104.6μmol/g。2、水凝胶的凝胶时间小于10 min,凝胶内部为疏松多孔结构,含水量均高于95%,水凝胶在PBS溶液中可稳定存在28天且能被15 U/m L的透明质酸酶溶液完全酶解,弹性模量在中枢神经系统的模量范围。3、HGA的引入增强了水凝胶的抗氧化性能。HT0.5HGA0.5水凝胶对DPPH自由基的清除能力达到77.21±0.26%,对羟基自由基的清除能力达到98.89±0.80%。它可以保护细胞免受H2O2诱导的氧化损伤。4、CCK-8实验表明细胞与HT0.5HGA0.5水凝胶的浸提液共培养1天和2天后,细胞活力大于80%,说明水凝胶具有良好的细胞相容性;溶血率低于1%表明该水凝胶血液相容性良好;皮下注射没有引起明显的炎症反应证明了其良好的组织相容性。第二部分:HT/HGA水凝胶移植对TBI小鼠神经修复作用的研究1、成功建立了中度C57 TBI模型。与NS组和HT组相比,HT/HGA(HT0.5HGA0.5)水凝胶移植3天后激活Nrf2/HO-1信号通路,同时在治疗3天和21天后,小鼠病灶区MDA含量显著下降（P＜0.05）,GSH含量显著上升（P＜0.05）。此外,HT/HGA水凝胶处理21天后可以显著下调促凋亡蛋白Bax（P＜0.05）、促炎因子TNF-α和IL-6的表达,上调凋亡抑制蛋白Bcl-2和抑炎因子IL-4的表达。治疗21天后的免疫荧光结果显示,HT/HGA水凝胶抑制了iNOS（M1型小胶质细胞）的表达并促进Arg-1（M2型小胶质细胞）的表达。以上结果说明水凝胶处理可以通过上调Nrf2/HO-1信号通路缓解氧化应激,促进小胶质细胞的M2型极化并调节炎症反应,最终改善脑部微环境,抑制神经细胞死亡。2、与NS组相比,HT/HGA水凝胶处理组可减少伊文思蓝染液的外渗,提高TBI小鼠糖水偏好指数,显著降低m NSS评分,缩短水迷宫实验中的潜伏期,增加穿越平台次数和目的象限停留时间。以上这些结果说明HT/HGA水凝胶处理可降低血脑屏障的通透性,缓解小鼠的抑郁情绪,改善小鼠的运动、学习和记忆功能。3、移植21天后,与NS组相比,HT/HGA水凝胶组上调了脑组织病灶区的神经元特异性蛋白（β-Ⅲtublin、NFL、NSE、NeuN）的表达,其中NeuN和NFL的表达具有显著性差异（P＜0.05）。此外,海马DG区的Ki67和NeuN阳性细胞数也显著增加（P＜0.05）,以上结果表明HT/HGA水凝胶处理促进了神经元的存活与再生。结论:1、HT/HGA水凝胶具有高含水率、生物可降解性、较强的自由基清除能力、类似神经组织的弹性模量。2、HT/HGA水凝胶原位移植可显著降低小鼠血脑屏障的通透性,改善小鼠抑郁情绪,促进小鼠运动、学习和记忆功能的恢复。潜在的分子机制可能是通过激活Nrf2/HO-1信号通路抑制氧化应激和炎症反应,从而改善TBI小鼠病灶区恶劣的微环境,减少神经元凋亡,促进神经元的存活与再生。