目的:CD4+T细胞在特异性免疫应答中发挥重要作用。初始CD4+T细胞接受抗原刺激后，可分化为Th1、Th2、Th17(T helper cell17，Th17)及Treg(regulatory T cells，Treg)细胞，发挥不同的生物学作用。目前认为Th17与Treg在类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)等自身免疫性疾病中发挥重要作用。Treg细胞表达叉状翼状螺旋转录因子(foxkhead/wingedhelix transcription factor, Foxp3)和CD25，在抑制炎症和自身免疫应答中发挥作用。Th17细胞表达特异性转录因子RORC(retinoicacid-related orphan receptor C)，主要分泌白细胞介素-17(interleukin-17，IL-17)。IL-17是一种强大的促炎性细胞因子，可促进自身免疫性疾病的发生发展。　　 羟氯喹(Hydroxychloroquine，HCQ)是由4-氨基喹啉化合物构成的硫酸羟氯喹，可抑制多形细胞核的趋化性从而抑制炎症，HCQ呈剂量依赖性抑制IL-2的分泌，以及IL-1A、IL-1B、IL-6和肿瘤坏死因子-α(Tumornecrosis factor，TNF-α)的产生。有研究表明HCQ可上调系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE小鼠脾细胞中CD4+Foxp3+细胞数量对SLE发挥治疗作用，可增加Treg细胞数量对人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiency virus，HIV)感染具有明显免疫抑制作用，但具体机制尚不明确。HCQ是否可以通过影响Treg/Th17细胞的分化平衡治疗RA，目前尚无相关文献报道，因此本课题以健康人外周血初始CD4+T细胞为研究对象，观察HCQ对Treg/Th17细胞分化的影响，进而确定HCQ是否通过调节Treg/Th17细胞的分化，参与人体的免疫调节，达到治疗RA作用。　　 方法:　　 1.HCQ对Treg细胞定向分化的影响　　 (1)Treg细胞的定向分化。免疫磁珠法分选健康人外周血初始CD4+T细胞，流式细胞术检测分选细胞的纯度;24孔细胞培养板预先用anti-CD3(5μg/ml)包被，4℃过夜。收集分选后的细胞，种于预包被的24孔板，加入anti-CD28(2μg/ml)、TGF-β1(5ng/ml)及IL-2(500IU/ml)，诱导初始CD4+T细胞向Treg细胞分化，培养7天。于不同时间收集细胞，观察Foxp3mRNA的时间依从性表达，流式细胞术检测CD25+Foxp3+T细胞数量。　　 (2)不同浓度HCQ对Treg细胞分化的影响。HCQ对Treg细胞Foxp3mRNA表达的影响:将细胞分为四组，对照组和HCQ(1nM、10nM、100nM)培养7d，收集细胞，观察Foxp3mRNA的表达情况;HCQ对CD25+Foxp3+细胞数量的影响:分为四组，对照组和HCQ(1nM、10nM、100nM)组，培养7d，收集细胞，流式细胞术检测CD25+Foxp3+T细胞数量。　　 2.HCQ对Th17细胞定向分化的影响　　 (1)Th17细胞的定向分化。24孔细胞培养板预先用anti-CD3(5ug/ml)包被，4包过夜。收集分选的初始CD4+T细胞，接种于预包被的24孔板，加入anti-CD28(2μg/ml)、TGF-β1(5ng/ml)、IL-6(15ng/ml)、IL-23(25ng/ml)、auti-IFN-γ（10tg/ml）及auti-IL-4(10tg/ml)，培养7天。7天时，anti-CD3（5μg/ml）包被的24孔细胞培养板中加入含anti-CD28（2μg/ml）的1640培养基，再培养24h，诱导初始CD4+T细胞向Th17细胞分化，于不同时间收集细胞，观察RORC mRNA的时间依从性表达;流式细胞术检测CD4+IL-17+T细胞数量。　　 (2)不同浓度HCQ对Th17细胞分化的影响。HCQ对Th17细胞RORCmRNA表达的影响:将细胞分为四组，对照组和HCQ(1nM、10nM、100nM)组，培养7d，收集细胞，观察RORC mRNA的表达情况;HCQ对CD4+IL-17+T细胞数量的影响:分为四组，对照组和HCQ(1nM、10nM、100nM)组，培养7d，收集细胞，流式细胞术检测CD4+IL-17+T细胞数量。　　 应用SPSS16.0软件进行统计学分析，数据用均数±标准差（(x)±s）表示，各组均数的比较行单因素方差分析(one-way ANOVA)，用最小显著差法(least significant difference，LSD)作两两比较，P＜0.05为有显著性差异。　　 结果:　　 1.HCQ对Treg细胞分化的调节　　 (1)免疫磁珠法分选健康人外周血初始CD4+T细胞，用流式细胞术检测分选细胞的纯度达98％以上;在anti-CD3，anti-CD28，TGF-β1及IL-2作用下Treg细胞关键转录因子Foxp3 mRNA在7d达表达高峰;在anti-CD3和anti-CD28存在的条件下，TGF-β1和IL-2作用7d后，可使细胞（30.83±5.77）％同时表达CD25和Foxp3，证明体外成功诱导初始CD4+T细胞分化为Treg细胞。　　 (2)不同浓度的HCQ在初始CD4+T细胞诱导分化为Treg细胞中均对Foxp3 mRNA的表达有促进作用，且呈剂量依赖性。HCQ(1nM、10nM、100nM)组(1.32±0.06、1.56±0.12、1.95±0.09)与对照组(1.0000±0.0000)相比差异均有统计学意义(P＜0.05); HCQ作用7d，流式细胞术检测CD25+Foxp3+T细胞数量:发现HCQ(1nM、10nM、100nM)组均可增加CD25+Foxp3+T细胞的数量，且呈剂量依赖性，HCQ1nM、10nM和100nM组(32.90±4.01、37.13±3.35、44.31±1.63)％与对照组(30.83±5.77)％相比差异有统计学意义（P＜0.05）。　　 上述结果显示HCQ促进人初始CD4+T细胞向Treg细胞的分化。　　 2.HCQ对Th17细胞分化的调节　　 (1)在TGF-β1、IL-6、IL-1β及IL-23作用下Th17细胞关键转录因子RORCmRNA在7d达表达高峰;培养7d时，(5.39±0.88)％的细胞同时表达CD4和IL-17，证明体外成功诱导初始CD4+T细胞分化为Th17细胞。　　 (2)不同浓度的HCQ在初始CD4+T细胞诱导分化为Th17细胞中均对RORC mRNA的表达有抑制作用，且呈剂量依赖性。HCQ(1nM、10nM、100nM)组(0.71±0.04、0.51±0.05、0.27±0.04)与对照组(1.0000±0.0000)相比差异均有统计学意义(P＜0.05); HCQ作用7d，流式细胞术检测CD4+IL-17+T细胞数量:发现HCQ(1nM、10nM、100nM)组均可减少CD4+IL-17+细胞的数量，且呈剂量依赖性，HCQ1nM、10nM和100nM组(3.55±0.85、2.69±0.78、1.82±0.46)％与对照组（5.39±0.88）％相比差异有统计学意义(P＜0.05）。　　 上述结果显示HCQ抑制人初始CD4+T细胞向Th17细胞的分化。　　 结论:　　 通过免疫磁珠法分选健康人外周血初始CD4+T细胞，成功诱导其向Treg和Th17细胞分化，首次证实HCQ对Treg细胞的分化有促进作用，对Th17细胞分化有抑制作用，且呈剂量依赖性。