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木本植物是大多生态系统中的主要生命形式,具有重要的经济、生态价值。杨属植物(Populus)由于自身特有的生物学特性,成为木本植物基因组研究中模式物种的首选。但目前进行的“杨树基因组计划”是从整个基因组入手,不仅工作量巨大,而且后期序列拼接时难免会留下缺口。因此构建杨树基因组单条染色体或染色体特定区段DNA文库,筛选每条染色体特异性分子标记,对推进“杨树基因组计划”的进程具有重要理论意义和应用价值。
本文以欧洲山杨(Populus tremula)为试验材料,首次将染色体微分离、微克隆技术引入杨树基因组研究中,建立了一套有效的木本植物染色体微操作技术体系,为该技术在木本植物基因组研究中的应用奠定了基础。进一步将染色体微操作技术与同源序列扩增技术有机结合,直接从单染色体中分离抗病基因同源序列(resistance gene analog,RGA),在单染色体水平上对RGA序列的分布模式、多样性水平、进化途径等方面进行了探讨,同时利用电子延伸技术获得抗病基因(resistance gene,R gene)候选序列,为杨树R基因的分离及研究开辟了新途径,同时为单染色体分子生物学研究提供了新思路。全文主要结果如下:
1.应用改进的染色体微分离技术,从欧洲山杨根尖细胞中分离出单条1号染色体,并应用LA-PCR(linker-adaptor PCR)技术成功扩增了单染色体DNA。以LA-PCR产物标记探针,进行染色体荧光原位杂交,发现荧光信号密集分布于1号染色体,但同时在其他染色体的着丝粒及端粒区域也有荧光信号检出。对1号染色体DNA扩增产物进行克隆,构建了包含约3.0×105个重组克隆的单染色体DNA文库,插入片段平均为800 bp,基本覆盖1号染色体。本研究首次在杨树基因组研究中引入染色体微操作技术,同时尝试进行染色体绘图研究,为杨树单染色体特异探针筛选、遗传图谱构建以及重要基因克隆定位等研究奠定了基础。
2.依据植物R基因中的NBS(nucleotide binding site)保守结构域设计简并引物,结合染色体微分离技术,首次从杨树单染色体中分离RGA序列,通过克隆、测序和比对分析,全新报道了23条杨树RGA序列(GenBank登录号:DQ104366--DQ104388)。通过聚类分析,发现源自1号染色体的RGA序列构成聚集相对紧密的3个组,不同序列间存在较高的相似性(>80％)；而源自基因组的RGA序列大多单独成组,且各组聚集相对分散,不同序列间相似性较低(4.2％～65％),趋异性表现明显。我们认为,这种聚类结果揭示了RGA序列分布的两种特性,即在基因组水平上的多样性和在染色体水平上的趋同性。
3.本试验中,所有杨树RGA序列及同属TIR-NBS-LRR类R基因的L6、M、N、RPP1、RPP5基因聚为一类,没有发现与non-TIR-NBS-LRR类R基因相聚的杨树序列。通过对其氨基酸序列的分析,发现除P-loop和“GLPLAL”基元外,还含有Kin-2、RNBS-A-TIR、RNBS-B、RNBS-C保守基元,进一步说明本研究获得的RGA序列为TIR-NBS类序列,这与聚类结果相一致。我们认为,杨树基因组中non-TIR-NBS类RGA序列的缺失,可能暗示植物界中NBS-LRR类R基因的分化仍在活跃进行,同时为R基因的趋异进化提供了新的试验证据。
4.以含连续ORF的RGA序列为查询探针,检索毛果杨(Populus balsamifera)基因组序列数据库,找到多条部分重叠且同源性很高的基因组DNA序列,应用电子延伸技术(in silico cloning),得到9条具有良好TIR、NBS、LRR等R基因特征结构域的全新R基因候选序列。通过BLAST检索,在GenBank数据库中未发现相同序列,序列已提交并被GenBank数据库收录(GenBank登录号:DQ270663--DQ270671),为今后进一步克隆杨树R基因奠定了基础。
5.以RGA-F/R为筛库引物,将欧洲山杨1号染色体DNA文库进行矩阵排列,成功地分离到与多条植物R基因NBS结构域高度同源的TIR—NBS类RGA序列(LA-NBS,GenBank登录号:DQ452617)。以LA-NBS为查询探针,检索毛果杨基因组序列数据库,应用电子延伸技术获得了全长5857 bp的毛果杨候选R基因(PBR-I,GenBank登录号:DQ452615)。依据PBR-I设计特异引物,在欧洲山杨基因组中分离到1条全新的R基因候选序列(PTR-I,GenBank登录号:DQ452616),该序列全长4484 bp,包含7个外显子和6个内含子,与多条杨树抗病性相关的EST存在较高同源性,全长cDNA序列均受EST完全支持。进一步的分析发现,PTR-I基因编码1143个氨基酸残基的通读序列,与已克隆的植物R基因高度同源,具有全部的TIR-NBS-LRR类R基因特征结构域。FQ—PCR(fluorescence quantitationPCR)结果表明,PTR-I基因在杨树叶片中组成型表达,但表达丰度较低,其表达受外源水杨酸的诱导。我们初步推测,PTR-I候选基因为欧洲山杨基因组中一条全新的TIR-NBS-LRR类抗病相关基因,其抗病信号的传递需要EDS1等下游基因的参与,同时水杨酸对其表达具有正反馈调节作用。