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近年来,基因工程蓝藻产乙醇作为第三代光直接生物合成燃料乙醇的生产技术受到越来越多的关注。本研究以产乙醇基因工程集胞藻PCC6803Syn-ZG25为研究对象,首先对影响基因工程集胞藻生长和乙醇产量的因素进行了较系统的研究与优化;随后在不同形式反应器中进行逐级放大培养,比较集胞藻的生长和乙醇产量变化;对培养过程中的微生物杂菌污染进行了初步评价,分离并鉴定出几株乙醇消耗菌,并考察了其对乙醇的消耗特性。获得的具体研究结果如下:
(1)考察了微量元素溶液、温度、磷浓度、接种浓度对集胞藻生长和乙醇产量的影响,结果显示,0-2倍范围内的A5微量元素溶液(以BG11中A5浓度为1)不会对产乙醇基因工程集胞藻的生长和乙醇产量产生显著影响。集胞藻最适生长温度为30℃,它无法在低温下正常生长和合成乙醇,短期高温培养尚能适应,但长期高温对集胞藻造成伤害,对乙醇生产不利。磷的添加能显著促进基因工程集胞藻的生长,从成本核算角度考虑,以添加24.15mg/L的磷为宜。接种浓度越高,藻细胞生长速度越慢,最佳接种浓度为OD730=2.0。
(2)盐胁迫能显著提高基因工程集胞藻的乙醇产量。随培养液中NaCl浓度提高,藻生长速率降低;盐胁迫损伤细胞光反应中心Ⅱ的活性,抑制细胞的光合作用。随盐浓度提高,集胞藻的内源性代谢产物乙醇产量显著提高,在20g/LNaCl中培养,乙醇产量较对照提高91.8%。在盐胁迫条件下,基因工程集胞藻通过调节光合作用和呼吸作用效率、提高乙醇脱氢酶的活性以应对胁迫,同时提高乙醇产量。
(3)气泡柱式反应器、平板式反应器、封闭式跑道池中培养的产乙醇基因工程集胞藻均生长良好,但是,随着培养规模的扩大,集胞藻的生长速度下降。培养两周后,0.2L气泡柱式反应器和2.0L平板式反应器中乙醇产量无明显差别,但55L封闭式跑道池反应器的培养液中几乎无乙醇积累,这可能与其培养液中污染的乙醇消耗菌有关。
(4)在放大培养过程中,培养液中易发生微生物杂菌污染导致培养后期的乙醇消耗。从染菌的集胞藻培养液中分离出四株能够代谢乙醇的菌,经鉴定分别为红酵母、季也蒙酵母、短波单胞菌和微杆菌。其中乙醇消耗能力最强的是红酵母,乙醇比消耗速率达到391g/(1015cfu·d);其次为季也蒙酵母,乙醇比消耗速率为80.1g/(1015cfU·d);短波单胞菌和微杆菌的乙醇比消耗速率远低于红酵母和季也蒙酵母。将分离出的菌株与产乙醇集胞藻共培养7d后,污染红酵母、季也蒙酵母、短波单胞菌、微杆菌的实验组乙醇产量分别下降了53.8%、23.6%、40.7%、27.3%。当培养液中污染少量乙醇消耗菌或污染的杂菌乙醇消耗速率较低时,培养液中乙醇积累开始减缓;而当污染的杂菌量较大或污染乙醇消耗速率较快的杂菌时,培养液中乙醇浓度迅速下降。四株菌对基因工程集胞藻的生长无明显影响,均可通过直接消耗乙醇而导致产乙醇基因工程集胞藻乙醇产量降低。