【摘 要】
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肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是全球最常见的肿瘤之一。2020年国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer,IARC)的数据显示,我国肝癌的发病率在所有癌症中排第五位,死亡率排第二位。目前,手术以及放化疗是治疗肝癌的主要方法,然而术后的高复发率和肿瘤的转移严重影响患者的治疗效果、预后以及生存期。而且
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肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是全球最常见的肿瘤之一。2020年国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer,IARC)的数据显示,我国肝癌的发病率在所有癌症中排第五位,死亡率排第二位。目前,手术以及放化疗是治疗肝癌的主要方法,然而术后的高复发率和肿瘤的转移严重影响患者的治疗效果、预后以及生存期。而且肝癌的发病隐匿,早期症状不明显,因此急需发掘和鉴定与肝癌发生发展相关的基因,并揭示其分子机制,从而为肝癌新的生物标志物的发现及防治措施的研发提供理论依据。甲基转移酶样蛋白16(Methyltransferase like protein 16,METTL16)是目前发现的第二种RNA N6-腺苷酸甲基化(m6A)转移酶,可催化某些编码和非编码RNA发生甲基化修饰。以往的研究表明,METTL16在多种肿瘤的发生发展中发挥着重要作用。例如,METTL16的表达下调与肝癌患者较低的总体生存率显著相关,提示METTL16在肝癌中可能发挥抑癌基因的功能。在胃癌中,Cyclin D1依赖METTL16介导的m6A修饰可增加自身m RNA的稳定性进而促进肿瘤的生长。然而,METTL16在肝癌中的功能以及其是否通过m6A修饰的方式调控肝癌的发生发展迄今未见报道。本研究旨在探索METTL16对肝癌细胞系HepG2和HCC-LM3的细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响及其潜在的分子机制。我们首先构建了METTL16过表达及干扰载体,并将其转染至HepG2与HCC-LM3细胞系,获得稳定过表达和敲低METTL16的肝癌细胞系。随后的一系列细胞表型实验结果显示,过表达METTL16可显著抑制HepG2以及HCC-LM3细胞的增殖、迁移和侵袭能力,并且导致S期细胞减少、G2/M期细胞增多,细胞周期被阻滞在G2/M期;反之,敲低METTL16可显著促进HepG2和HCC-LM3细胞的增殖、迁移和侵袭能力,导致S期细胞增多、G2/M期细胞减少。过表达或敲低METTL16对HepG2与HCC-LM3细胞系的凋亡无显著影响。上述结果初步提示METTL16在肝癌细胞中发挥抑癌基因的功能。为了进一步探索METTL16在肝癌细胞中的作用机制,我们在GEO数据库下载了一个来自中国人群的肝癌转录组数据集(编号:GSE14520),按照METTL16在肿瘤组织中表达值的中位数,将GSE14520数据集分为METTL16高表达和低表达两组,随后采用Network Analyst进行基因差异表达分析。进一步的Enrichr分析显示,差异表达基因显著富集于VEGFA-VEGFR2等信号转导通路。随后,我们通过Western blot法检测了扰动METTL16后对VEGFA-VEGFR2信号通路中一些关键节点蛋白分子表达水平的影响。结果显示,METTL16可显著抑制VEGFR2、p-AKT蛋白的表达。此外,为了探索METTL16阻滞细胞周期进程的分子机制,我们也检测了与细胞周期G2/M期相关蛋白Cyclin B和CDK1的蛋白表达水平。结果显示,过表达METTL16后显著降低了上述蛋白的表达水平。最后,为了探索METTL16的潜在临床意义,我们分析了GSE14520数据集中225个肝癌组织样本(其中有临床信息的癌组织样本为221个)和220个癌旁组织样本的表达谱数据及患者的临床信息。结果显示,METTL16在癌组织的表达水平显著低于癌旁组织;然而,METTL16的表达水平与肝癌患者的不良预后无显著的相关性。另外,为了进一步验证METTL16基因的抑癌功能,以及探索METTL16是否以m6A修饰依赖的方式调控肝癌细胞的表型,我们在HepG2和HCC-LM3细胞中通过CRISPR/Cas9技术成功构建了敲除METTL16基因的细胞系,为后续实验的开展奠定了基础。综上所述,我们通过细胞表型实验初步证明了METTL16在肝癌细胞中作为抑癌基因发挥其相应的生物学功能,进一步的机制探索也初步显示METTL16可能通过抑制VEGFA-VEGFR2信号通路而阻遏肝癌的发生发展。此外,METTL16在肝癌组织中显著低表达,提示METTL16可能成为肝癌预后的潜在分子标志物。
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