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背景:宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤,侵袭转移是导致宫颈癌患者死亡的重要原因之一。肿瘤微环境是由各种成分,如肿瘤细胞、细胞外基质、免疫细胞等共同组成的适宜肿瘤生长的特殊环境。肿瘤免疫微环境在肿瘤生长和转移中发挥关键作用。作为肿瘤微环境中的一个重要组成部分,免疫细胞在肿瘤进展中的作用不可忽视。其中,Th17细胞在肿瘤免疫微环境中的比例增加可提高宫颈癌细胞侵袭能力,从而推动宫颈癌的恶性进展。外泌体是指包含了复杂RNA和蛋白质的小囊泡,由多种细胞分泌至细胞外进行细胞间的信号传递,是微环境中肿瘤细胞和免疫细胞互作的重要信号传递分子,可直接或间接影响免疫细胞的发育、分化。但宫颈癌细胞来源的外泌体在Th17细胞分化中的调控作用及其相关机制目前尚无研究。目的:探讨宫颈癌细胞来源的外泌体调节肿瘤免疫微环境中Th17细胞分化,进而调控肿瘤的侵袭和免疫逃逸的分子机理,为进一步寻找宫颈癌治疗新思路和新靶标提供理论基础。方法:(1)通过靶向乙酰肝素酶(HPSE)基因的siRNA下调宫颈癌细胞株HPSE表达后,提取宫颈癌细胞来源外泌体,运用透射电镜扫描、纳米颗粒追踪分析、Western Blot技术对外泌体进行鉴定;荧光染料SytoRNA、Dil分别标记的外泌体与CD4~+T细胞共培养后,通过免疫荧光技术检测外泌体是否能被CD4~+T细胞有效吸收;运用流式细胞技术、酶联免疫吸附实验分别检测与外泌体共培养的CD4~+T细胞中Th17细胞分化比例、细胞增殖能力、细胞因子分泌能力。(2)利用Clariom D芯片对外泌体中lncRNA测序,对差异表达的lncRNA进行靶基因预测及基因功能(gene ontology,GO)分析、信号通路(KEGG pathway)分析,筛选出宫颈癌细胞来源外泌体中可能参与调控Th17细分化胞的lncRNA及其靶基因。(3)分离人外周血CD4~+T淋巴细胞,利用过表达载体或siRAN干预CD4~+T细胞中lncRNA-ENST00000610044和JAK3基因表达,流式细胞仪检测各组细胞中Th17细胞的分化比例;实时荧光定量PCR检测各组细胞中Th17细胞特征性转录因子Rorc、Th17特异性分泌因子IL-17A的表达水平;ELISA法检测各组细胞细胞因子IL-17A的分泌量;Western Blot方法检测JAK3/STAT3信号通路分子水平变化。结果:(1)课题组成功分离并鉴定了宫颈癌细胞来源的外泌体:透射电镜形态学清晰显示出外泌体的囊泡状结构;纳米颗粒追踪分析显示外泌体符合30-150nm大小粒径;Western Blot显示囊泡内含有CD63、CD81标志性蛋白。CD4~+T细胞可有效吸收宫颈癌细胞来源外泌体;宫颈癌细胞来源外泌体可促进Th17细胞分化以及细胞因子IL-17A的分泌(P<0.05),而与CD4~+T细胞增殖、细胞因子(IFN-γ、IL-4、TGF-β)分泌无关(P>0.05)。(2)通过基因芯片对HPSE正常及下调的SiHa细胞来源的外泌体中lncRNA进行比对分析,筛选出了多种差异表达lncRNA。KEGG信号通路富集分析显示差异lncRNA主要参与mTOR信号通路、Th17细胞分化信号通路、免疫系统调节等。在众多差异表达的lncRNA中,位于chromosome 1上的lncRNA-ENST00000610044同时满足以下特点:ENST00000610044在SiHa细胞来源的外泌体中表达水平显著高于HPSE下调的SiHa细胞来源的外泌体;上调CD4~+T细胞中ENST00000610044表达后,Th17分化比例显著升高;ENST00000610044靶基因预测分析,发现JAK3、SMAD4等与T细胞分化有关的基因。(3)与对照组相比,上调CD4~+T细胞中ENST00000610044后,Rorc、IL-17A基因的表达水平显著增加(P<0.05),细胞因子IL-17A的分泌显著上升(P<0.05),JAK3/STAT3磷酸化水平显著升高(P<0.05);而JAK3基因下调后作用完全相反,Rorc、IL-17A基因表达水平显著降低(P<0.05),细胞因子IL-17A的分泌显著减少(P<0.05),JAK3/STAT3磷酸化水平显著降低(P<0.05)。结论:宫颈癌细胞外泌体内含物可被CD4~+T细胞有效摄取,进入CD4~+T细胞的ENST00000610044可通过激活JAK3激酶,进而招募并磷酸化STAT3蛋白,活化的STAT3蛋白入核,增强转录因子RORC的转录活性,促进Th17细胞分化,进而促进宫颈癌侵袭转移。本研究为进一步认识宫颈癌侵袭转移的分子机制和治疗新靶标提供了实验依据。