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日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)是最具养殖价值的对虾品种之一。高氨氮、低pH是影响其养殖效果的重要环境因子,由于工厂化养殖模式下饵料及排泄物的积累、人类活动及气候变暖致使水环境不断恶化,高氨氮和低pH胁迫对日本囊对虾养殖业造成的影响日趋严重。因此提高日本囊对虾的高氨氮、低pH抗性,选育对氨氮、pH胁迫具有较强抗性的新品种势在必行。但传统的育种方法成本高、周期长,对低遗传力性状改良效果不明显。所以本研究采用转录组测序方法,分析日本囊对虾响应高氨氮、低pH胁迫的分子机制,挖掘相关应激响应基因;克隆获得应激响应基因几丁质酶4(MjChi4)全长c DNA,利用qRT-PCR和RNA干扰分析,进一步验证其可能参与对虾抗高氨氮和抗低pH功能。本研究对加快日本囊对虾抗高氨氮、低pH新品种选育具有重要意义。主要研究结果如下:(1)高氨氮应激下日本囊对虾转录组分析采用RNA-seq方法对高氨氮胁迫下日本囊对虾的肝胰腺进行分析,从10个转录本中获得44,735,330–56,680,154个clean reads,有80.20%–82.38%的reads被映射到参考转录本。鉴定了2294个差异表达基因,其中许多与免疫功能、氧化应激、凋亡、蜕皮和膜有关;共富集了36个GO条目和177个KEGG通路。此外,高氨氮胁迫显著改变MjChi4的表达,显著上调热休克蛋白90(HSP90)、HSP10和抗氧化酶(过氧化氢酶和谷胱甘肽S-转移酶);富集氨基酸代谢、溶酶体、过氧化物酶体、m TOR、PI3K-Akt及AMPK信号传导通路。(2)低pH应激下日本囊对虾转录组分析采用RNA-seq方法对低pH胁迫下日本囊对虾的肝胰腺进行分析,从12个转录本中获得46,250,194–68,423,114个clean reads,鉴定了2702个差异表达基因,共富集到56个GO条目和222个KEGG通路。低pH胁迫显著改变MjChi4、消化酶、抗氧化酶(胞质锰超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽S-转移酶)和HSPs的基因表达;亚油酸和花生四烯酸代谢、溶酶体、卵巢类固醇生成、PPAR和AMPK信号通路显著富集。(3)应激响应基因MjChi4的功能分析采用转录组测序获得应激响应基因MjChi4,利用RACE克隆技术获得MjChi4全长c DNA,2124 bp,编码613个氨基酸。生物信息学分析发现,MjChi4具有1个Sec信号肽(Sec/SPI),1个Glyco＿18和2个Cht BD2功能域;不存在跨膜区。qRT-PCR分析显示,MjChi4在肝胰腺中表达最高;氨氮胁迫下MjChi4表现先上升后下降再上升的表达模式;pH胁迫下前24 h表现为先下降后恢复的周期性变化,24 h后为先上升后恢复的表达模式。RNA干扰MjChi4后,在高氨氮、低pH胁迫下对虾的存活率下降及死亡时间显著提前;使几丁质酶(MjChi1、MjChi2、MjChi3)、抗病毒蛋白、C型凝集素、C型溶菌酶和酚氧化酶原b的表达均显著下降,胞浆Mn SOD与Imd信号通路转录因子relish显著上调。