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球孢白僵菌（Beauveria bassiana）是环境友好广谱真菌杀虫剂的主要来源之一,剂型化分生孢子作为生防真菌制剂的有效活性成分,其基于规模化生产工艺的产量和质量决定着产品的成本和田间应用效果。在自然界,僵死虫尸体表产生的分生孢子维持其在寄主栖境中的侵染循环和扩散传播。在丝状真菌中,分生孢子的产生和成熟是受中心发育通路（Central Developmental Pathway,CDP）调控的无性发育过程,调控这一过程的基因包括CDP的激活基因brl A、aba A、wet A及其下游的vos A。这一最早在模式真菌构巢曲霉中揭示的调控过程已在球孢白僵菌中得到充分证明。在构巢曲霉中,关键CDP基因brl A的激活受无性发育上游激活通路（Upstream Developmental Activation Pathway,UDAP）的调控,UDAP包含被称为核心调控因子的Flu G和五个伴随Flu G的调控因子Flb A-Flb E。然而,后基因组时代揭示出的丝状真菌基因组歧化,让人们置疑上述模式真菌无性发育的调控机制是否适用于子囊菌盘菌纲,而充分认识这一调控机理对分生孢子规模化生产工艺的设计和改进具有重要意义。因此,本研究围绕组成球孢白僵菌UDAP的Flu G和Flb A-Flb E以及新发现的Flu G类似调控因子（Flu G-like regulator）Flr A进行研究,目的是揭示构巢曲霉CDP的激活模式是否适用于球孢白僵菌。主要研究结果摘要如下:球孢白僵菌Flu G的功能与调控作用构巢曲霉的UDAP由以flu G为核心的flu G-flb A、flu G-flb E/B/D和flu G-flb C三条级联路径激活CDP的关键基因brl A而启动无性发育。在球孢白僵菌中,绿色荧光标记的同源Flu G融合蛋白定位于分生孢子及芽生孢子的细胞核内,在菌丝细胞核内的积累水平高于细胞质中且不受光周期影响。flu G的缺失突变对菌落生长的影响微乎其微,并无构巢曲霉flu G突变株菌落的所谓“蓬松状（fluffy）”即不产孢表型。flu G缺失株仅表现出有限的产孢缺陷,在正常培养第3-5 d的产孢量较野生株下降40%,产孢缺陷随着培养时间延长而减轻,最终产孢仅下降10%。期间,flb A-flb E和CDP基因以及另一个flu G类似基因呈现差异表达,显示并未因flu G的缺失而被转录抑制。flu G缺失株的孢子质量受损,分生孢子正常萌发50%所需时间GT50延长4 h,对45℃湿热胁迫和UVB辐射的耐受力分别下降54%和29%。氧化、高渗、胞壁干扰和热激胁迫均显著或大幅抑制缺失株的菌落生长,吻合若干胁迫应答基因的转录表达下调或强烈抑制。在标准化生物测定中,缺失株经正常体壁侵染大蜡螟幼虫的致死中时LT50较野生株大幅延长6 d,主要原因在穿透体壁的胞外酶和Pr1家族蛋白酶的总酶活分别下降90%以上,菌丝侵入寄主血腔后形成虫菌体（hyphal bodies）的时间延迟且形成初期增殖缓慢。在模拟昆虫血淋巴的TPB培养液中培养48 h,flu G缺失株的芽生孢子产量较野生株净增149%,培养期间调控产孢的关键CDP基因brl A和aba A的转录水平大幅上调。结果表明,flu G并非球孢白僵菌UDAP中激活关键CDP基因而启动无性发育的调控因子,而是球孢白僵菌适应昆虫致病性生活方式及其环境的重要调控因子。球孢白僵菌flb A-flb E的功能及调控作用在构巢曲霉中,flb A、flb B、flb C及flb D、flb E都是UDAP中以flu G为核心的CDP关键基因brl A的调控因子,其单基因缺失均导致“蓬松状”表型,是众所周知的上游发育激活通路的参与调控因子。在球孢白僵菌中,五个flb基因的单基因敲除突变株中,只有（35）flb A和（35）flb D分别参与对热激和H2O2诱导的胁迫应答,但所有敲除株在正常和不同胁迫条件下的菌落生长都类似于野生和回补菌株。敲除株（35）flb A和（35）flb B的分生孢子产量较野生株下降30%左右,而（35）flb C和（35）flb E仅下降了大约15%,其中CDP基因brl A和aba A在（35）flb A和（35）flb C中的表达受到持续抑制。在模拟昆虫血淋巴的TPB培养液中,（35）flb A只长菌丝不产芽生孢子,其brl A和aba A的表达几乎被完全持续抑制;（35）flb C的芽生孢子产量下降55%,只有aba A的表达被持续抑制。在标准化生物测定中,无论体壁浸染还是血腔注射侵染,（35）flb A和（35）flb C的毒力均较野生株显著弱化,尤以前者弱化更多,因为其血腔定殖能力受损更严重。结果表明,flb A在球孢白僵菌昆虫致病生活中的作用大于flb C,但flb B、flb D及flb E却不起明显的作用。这一研究揭示了flb A-flb E在球孢白僵菌中的作用不同于文献所载其同源基因在构巢曲霉中的主要作用。球孢白僵菌Flr A的功能及其与Flu G转录调控作用的比较许多丝状真菌基因组中存在多个类似Flu G的调控因子（Flu G-like regulators,FLRs）,且被注释为谷氨酰胺合成酶或假定蛋白,但在子囊菌中的功能未见研究报道。本研究通过分析球孢白僵菌中唯一FLR即Flr A的单基因缺失（SD）菌株与Flr A和Flu G的双基因缺失（DD）菌株,以揭示Flr A和Flu G是否为UDAP中激活关键CDP基因表达所必需的调控因子,并比较二者的生物学功能及转录调控作用。同Flu G一样,荧光标记的Flr A融合蛋白在细胞核中比在细胞质中积累更多,但酵母双杂交证明Flr A和Flu G之间不存在蛋白水平相互作用,意味着二者在功能上是相互独立的。三个SD菌株表现出先前（35）flu G突变株几乎完全一致的表型,包括分生孢子产量下降有限,芽生孢子产量大幅提高,孢子质量受损,试虫感染过程受阻,血腔增殖延迟,毒力大幅减弱,对氧化、高渗、胞壁干扰和热激胁迫的敏感性显著升高。三个DD菌株的大多数表型很接近SD菌株,但对昆虫的致病性和毒力更弱,对热激胁迫或荧光白诱导的胞壁胁迫更加敏感。在SD和DD突变株中,5个flb基因和CDP基因在转录水平上仍然活跃。基于flr A和flu G单基因突变株相对于野生株的转录组分析显示,flr A和flu G的缺失分别导致1,622和2,234个基因的显著失调,上调/下调比分别为635:987和780:1454,而其中并无CDP基因。令人惊讶的是,多达1,415个失调基因（上调/下调比为540:875）在（35）flr A和（35）flu G缺失株中分别呈相同或相近水平的共上调或共下调,占基因组百分比高达13.65%。这些发现揭示了Flr A和Flu G相互间在基因组水平上大幅重叠的转录调控作用,揭示了二者对球孢白僵菌适应昆虫致病性生活方式及环境的重要意义,更揭示了二者都不是球孢白僵菌UDAP的核心调控因子。由此证明,构巢曲霉CDP基因的上游激活模式并不适合于肉座菌目虫草科的球孢白僵菌。