多发性硬化(multiple sclerosis，MS)是一种常见的以中枢神经系统(central nervoussystem，CNS)炎性脱髓鞘病变为特征的自身免疫性疾病。实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)是生命科学界公认的MS动物模型。MS患者和EAE动物共同的特点是发病后存在自我缓解的现象，这是大脑限制过强免疫应答的一种自我保护作用，提示CNS中存在对脑内自身抗原进行负向免疫调控的效应。但是，负向免疫调控的关键启动细胞是什么？负向免疫调控的作用机制是什么？中枢神经系统存在特化的组织吞噬细胞称为小胶质细胞(microglia)，被认为是CNS潜在的抗原提呈细胞（antigen presenting cell，APC）。PD-L1/PD-1(programmed cell deathligand-1/programmed death-1，PD-L1/PD-1)属于B7/CD28共刺激分子超家族的重要成员，是免疫反应效应阶段的负向调节信号通路，可通过调控T细胞的活性来诱导并维持的外周免疫耐受。研究表明，EAE发病动物CNS中PD-L1的表达逐渐增加，阻断PD-L1/PD-1信号通路造成EAE发病时间缩短并加重临床症状。由于小胶质细胞在脑组织中数量众多，且参与生理条件下的免疫赦免，那么疾病条件下它们是否表达PD-L1并通过PD-L1途径发挥免疫调节作用尚无人深入研究。　　为此本课题将观察小胶质细胞在MOG35-55(myelin oligodendrocyte glycolprotein，MOG)诱导的EAE小鼠模型中数量及PD-L1表达的动态改变;明确小胶质细胞是否对T细胞具有抑制作用;探讨PD-L1分子是否具有调控小胶质细胞抑制作用的功能。本研究试图阐明小胶质细胞与EAE疾病进展和转归的关系，明确其在CNS负向免疫调控中所扮演的角色，为寻找CNS免疫性疾病的治疗靶点提供理论基础和实验依据。本研究主要包括五部分的内容:　　(1)MOG35-55诱发C57BL/6小鼠EAE模型的构建　　我们成功建立了人MS的C57BL/6小鼠EAE模型。用MOG35-55肽段并辅以结核杆菌及百日咳毒素免疫EAE敏感动物品系C57BL/6小鼠，免疫后第10天开始陆续发病，出现EAE典型的神经系统临床症状，病程为慢性单时相进展型，约在第20天达到发病高峰，同时伴随CNS组织的病理改变，HE染色检测结果发现，在脊髓白质区血管周围有大量淋巴细胞浸润，即呈“袖套样”炎性结构改变。而对照组动物始终未出现任何的神经系统症状，CNS中也未见任何病理学改变的征象。　　(2)动态监测EAE小鼠模型中小胶质细胞的数量、表型和活化状态　　采用流式细胞仪检测结果显示未处理组小鼠CNS的小胶质细胞(CD45lowCD11b+)占CD45+细胞的92.9％，EAE组小胶质细胞所占比例持续下降，高峰期比例下降至46.2％，恢复期逐渐回升。小胶质细胞绝对计数显示细胞数量呈现持续上升的趋势，与未处理小鼠比较，发病前期小胶质细胞的数量上升，但是并不明显(P＞0.05)，发病初期、发病中期及高峰期与未处理组对比具有统计学意义(p＜0.05)。小胶质细胞的数量与疾病进展具有明显的相关性。　　(3)动态监测EAE模型小鼠CNS中CD4+T细胞的数量、PD-1的表达及其细胞亚群　　本研究检测EAE模型中CNS浸润的CD4+T细胞的比例，结果显示，CD4+T细胞在临床症状出现前已进入CNS，CD4+T细胞所占CD45+细胞的比例逐步上升，高峰期比例最高，达到20.8％，随后比例下降，表明发病高峰期某种因素触发了大量T细胞凋亡，从而促进了疾病的恢复。同时流式细胞术结果显示CNS浸润的CD4+T细胞表达PD-1进行性增加，高峰期表达量最高，有统计学意义(p＜0.05)。　　本研究同时采用了免疫组织荧光标记技术标记CD4分子和PD-1分子，结果显示，EAE高峰期的脊髓切片中可见大量CD4+/PD-1+的细胞，且细胞分布与活化小胶质细胞聚集部位相吻合，为确定小胶质细胞与CD4+T细胞存在相互作用的可能性提供了形态学依据。　　本实验动态监测了EAE不同时期脑和脊髓中Th1和Th17细胞的变化，结果表明，随着EAE病程的进展，IFN-γ和IL-17的表达呈现逐渐升高趋势，发病中期比例达到最高，随后比例下降，提示此时效应性CD4+T细胞可能发生了凋亡。本实验同时检测了CD4+ Foxp3+调节性T的动态变化，结果显示，CD4+ Foxp3+调节性T细胞在脑中持续上升，高峰期达到最高，为34.6％，缓解期下降。本实验的数据表明EAE高峰期IL-17和IFN-γ表达呈下降趋势，而Treg继续呈现聚集和扩增，说明效应性T细胞的下降和Treg细胞的上调是限制CNS过强炎症反应的基本因素。　　(4)利用小胶质细胞与OVA323-339抗原特异性CD4+T细胞体外共培养系统验证小胶质细胞具有免疫抑制作用　　小胶质细胞与OTⅡ特异的初始CD4+T细胞共培养观察小胶质细胞对初始T细胞的抗原提呈能力，结果显示，小胶质细胞具有一定的刺激T细胞增殖的能力即具有抗原提呈功能，但是该能力显著低于脾脏DC(spleen Dendrtitic cell，spDC)的作用。同时实验数据显示小胶质细胞可诱导Th1细胞的产生，但是Th17不受影响。　　将小胶质细胞体外加入到spDC/CD4+T细胞共培养体系中，观察它是否能够抑制由DC刺激所引起的CD4+T细胞的增殖。在spDC/CD4+T细胞共培养体系中加入小胶质细胞后，CD4+T细胞绝对计数显著降低，表明EAE小胶质细胞能显著抑制由DC刺激引起的CD4+T细胞的增殖。同时观察该培养体系中T细胞亚群情况发现加入小胶质细胞组与单纯spDC/CD4+T细胞组比较，CD4+IFN-γ+细胞明显减少，均具有统计学意义(p＜0.05)，Th17无明显变化。结果说明，EAE小胶质细胞可抑制spDC诱导的Th1细胞分化，但是不影响Th17的分化。　　(5)探讨小胶质细胞发挥免疫抑制作用的机制　　为了探讨小胶质细胞发挥免疫抑制作用的机制，我们检测了共培养体系中Treg细胞的变化，结果显示，EAE-microglia/T组的Treg细胞的比例明显高于单纯CD4+T组，具有统计学差异(p＜0.05); spDC/T组加入EAE高峰期小胶质细胞后，Treg的比例明显增高(p＜0.05)。结果说明小胶质细胞可通过诱导Treg细胞发挥免疫抑制作用。　　为了验证一氧化氮(nitric oxide，NO)是否参与了小胶质细胞的抑制作用，本课题采用实时定量PCR检测小胶质细胞一氧化氮合酶的表达情况，结果发现EAE发病高峰期小胶质细胞表达一氧化氮合酶明显高于未处理组(p＜0.05)，表明小胶质细胞可能通过释放NO来抑制T细胞的增殖。于是，本实验在共培养体系中加入一氧化氮合酶抑制剂L-NAME，以观察去除NO后，小胶质细胞的抑制作用是否得到逆转？结果发现，加入NO合酶抑制剂的确可以使CD4+T细胞的增殖得到显著恢复，提示小胶质细胞分泌的NO参与了对CD4+T细胞的抑制功能。然后，我们检测了不同处理组上清中NO的OD值，结果显示，与spDC/T组比较，在包含EAE高峰期小胶质细胞的实验组均产生大量NO(p＜0.05)。因此，结果显示小胶质细胞可通过释放NO来抑制抗原特异性T细胞反应。　　(6)体外阻断PD-L1/PD-1途径观察小胶质细胞的免疫抑制功能　　在microglia/T培养体系中，加入阻断性anti-PD-L1抗体后CD4+T细胞的数量显著增加(p＜0.05)，同样的结果出现在microglia/spDC/T共培养体系中。但是与spDC/T比较，CD4+T细胞增殖恢复并不完全，说明PD-L1部分参与了由小胶质细胞介导的抑制作用，但是并不是全部作用都由其引起，肯定还有其他因素起作用，有待于进一步研究。　　为明确PD-L1是否能够影响小胶质细胞对T细胞的分化作用，本课题同样检测了阻断PD-L1后CD4+T细胞亚群的变化。实验显示，在microglia/T和microglia/spDC/T两种共培养体系中阻断PD-L1均可使Th1细胞数量显著性增加(p＜0.05)，表明PD-L1具有抑制Th1细胞分化的作用。　　无论是在microglia/T还是在microglia/spDC/T培养体系，Treg细胞的比例均无明显差异(P＞0.05)，表明PD-L1并不参与小胶质细胞诱导Treg细胞产生的过程。本研究检测了共培养体系上清中NO的分泌，结果显示阻断PD-L1组上清中NO检测液的OD值明显低于同型对照抗体组，提示PD-L1可通过影响小胶质细胞分泌NO而调控T细胞的增殖。　　综上所述，本课题研究表明EAE高峰期的小胶质细胞是一群具有免疫抑制表型和功能的免疫细胞，通过诱导Treg、分泌NO发挥免疫抑制作用。EAE高峰期小胶质细胞高表达PD-L1分子，该分子通过影响小胶质细胞分泌NO发挥免疫调控作用。　　本课题明确证实小胶质细胞具有免疫抑制作用，为进一步开展CNS负向免疫调控机制的研究提供了理论依据，而且为临床工作中MS的诊断和治疗提供新的思路和潜在药物作用靶点，具有重要的临床应用价值。