论文部分内容阅读
一、目的通过考察四种抗结核药物(异烟肼、左氧氟沙星、乙胺丁醇和吡嗪酰胺)对P-糖蛋白功能和表达的影响,以及进一步验证利福平对P-糖蛋白功能和表达的诱导作用,初步研究四种抗结核药物与P-糖蛋白的相互作用。二、方法1细胞培养及形态学验证为四种抗结核药物对P-糖蛋白(P-gp)功能和表达的作用研究提供P-gp载体细胞和阴性对照细胞。脐静脉内皮细胞(ECV304)和人结肠癌细胞(Caco-2)分别采用1640培养基、MEM培养基进行常规培养;细胞免疫荧光法进行细胞膜上P-gp表达验证。2细胞毒性试验采用苯基溴化四氮唑蓝法(MTT)分别考察四种抗结核药物、利福平和维拉帕米对Caco-2细胞的毒性,以确定其体外最大无毒浓度(即细胞存活率大于90%的药物浓度),保证试验过程中细胞的活力。3四种抗结核药物对P-糖蛋白功能的影响采用流式细胞仪测定细胞内荧光强度,以利福平作为P-gp功能诱导的阳性对照,维拉帕米作为P-gp功能抑制的阳性对照,分别考察四种抗结核药物对经典P-gp功能探针药物——罗丹明-123(Rh-123)摄取作用的影响,从而判断P-gp功能的变化。4从蛋白水平研究四种抗结核药物对P-糖蛋白表达的影响以利福平作为P-gp表达上调的阳性对照,维拉帕米作为P-gp表达下调的阳性对照,不加药处理的Caco-2细胞作为阴性对照,采用流式细胞术分别分析四种抗结核药物对Caco-2细胞上P-gp表达的影响。5从mRNA水平研究四种抗结核药物对MDR1 mRNA表达的影响以利福平作为MDR1基因mRNA上调的阳性对照,维拉帕米作为MDR1基因mRNA下调的阳性对照,不加药处理的Caco-2细胞作为阴性对照,采用实时荧光定量PCR技术分别分析四种抗结核药物对Caco-2细胞MDR1基因mRNA水平表达的影响。三、结果1细胞培养及形态学验证Caco-2细胞和ECV304细胞在正常条件下生长旺盛;Caco-2细胞高表达P-gp,可用于研究四种抗结核药物对P-gp功能和表达的影响;ECV304细胞低表达P-gp,适合作为阴性对照细胞。2细胞毒性试验3d的MTT结果显示四种抗结核药物、利福平及维拉帕米对Caco-2细胞的最大无毒浓度分别为:异烟肼(INH)150μmol/L,左氧氟沙星(LVFX)5μmol/L,乙胺丁醇(EMB)150μmol/L,吡嗪酰胺(PZA)200μmol/L,利福平(RFP)100μmol/L,维拉帕米(VER)10μmol/L。因此,在后续的10d、20dMTT实验中选择用于长期含药培养的四种抗结核药物、利福平及维拉帕米的浓度分别为:INH为80μmol/L,LVFX为2μmol/L,EMB为301μmol/L,PZA为100μmol/L(各药物浓度均接近人常规剂量给药后的血药峰浓度);RFP为10μmol/L,VER为10μmol/L。最终的MTT结果显示:各细胞存活率均大于90%。因此,选择的各药物浓度适用于研究长期的含药培养对P-gp功能和表达的影响。3四种抗结核药物对P-糖蛋白功能的影响作用1h后,四种抗结核药物显著减少了Rh-123在Caco-2细胞内的蓄积(P＜0.05),说明四种抗结核药物均增强了P-gp的外排功能,即对其功能有诱导作用;作用3d后,四种抗结核药物反而都增加了Rh-123在Caco-2细胞内的蓄积(P＜0.05),说明随着作用时间延长,四种抗结核药物又削弱了P-gp的外排功能,即对其功能有抑制作用;作用10d后,LVFX仍然是增加了Rh-123在Caco-2细胞内的蓄积(P＜0.05),为抑制作用;而其他三种抗结核药物则都减少了Rh-123在Caco-2细胞内的蓄积(P＜0.05),转为诱导作用;作用20d后,LVFX仍为抑制作用(P＜0.05);INH、EMB和PZA仍为诱导作用(P＜0.05)。4四种抗结核药物对P-糖蛋白表达的影响作用1h后,四种抗结核药物分别干预组与阴性对照组比较,P-gp的表达量差异没有统计学意义,说明瞬时(1h)的药物干预对P-gp的表达量几乎没有影响;作用3d后,四种抗结核药物均下调了Caco-2细胞上P-gp的表达(P＜0.05),各组的P-gp表达量仅为阴性对照组的40%左右;作用10d后,INH、EMB和PZA均上调了Caco-2细胞上P-gp的表达(P＜0.05),其中INH、EMB的P-gp表达量约为阴性对照组的4-7倍,PZA约为阴性对照组的1.4倍;而LVFX则下调了Caco-2细胞上P-gp的表达(P＜0.05),其P-gp表达量约为阴性对照组的50%;作用20d后,INH、EMB、PZA均上调了Caco-2细胞上P-gp的表达(P＜0.05),其中INH、EMB的P-gp表达量约为阴性对照组的4倍,PZA约为阴性对照组的1.2倍;而LVFX则下调了Caco-2细胞上P-gp的表达(P＜0.05),其P-gp表达量约为阴性对照组的50%。5四种抗结核药物对MDR1 mRNA表达的影响作用1h后,四种抗结核药物干预组与阴性对照组比较,MDR1mRNA的表达量差异没有统计学意义,说明瞬时(1h)的药物干预对MDR1 mRNA的表达量也几乎没有影响;作用3d后,四种抗结核药物均下调了Caco-2细胞上MDR1mRNA的表达(P＜0.05),各组的MDR1 mRNA表达量仅为阴性对照组的30%左右;作用10d后,INH、EMB和PZA均上调了Caco-2细胞上P-gp的表达(P＜0.05),其中INH、EMB的MDR1 mRNA的表达量为阴性对照组的12倍,PZA约为阴性对照组的1.3倍;而LVFX则下调了Caco-2细胞上MDR1 mRNA的表达(P＜0.05),其MDR1 mRNA表达量约为阴性对照组的30%;作用20d后,INH、EMB和PZA均上调了Caco-2细胞上P-gp的表达(P＜0.05),其中INH、EMB的MDR1 mRNA表达量约为阴性对照组的5.5～9.0倍,PZA约为阴性对照组的1.2倍;而LVFX则下调了Caco-2细胞上MDR1 mRNA的表达(P＜0.05),其MDR1 mRNA表达量约为阴性对照组的35%。四、结论LVFX很可能是P-gp的抑制剂;INH和EMB可能是P-gp的诱导剂,但有待进一步验证;PZA很有可能与P-gp无明显的相互作用,也需进一步的研究证实。