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近年来，关于肠道微生物群对结直肠癌（Colorectal Cancer，CRC）发生发展及转移影响的研究急剧增加。结直肠癌作为全世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，具有高发病率、高死亡率、患者预后较差，容易出现复发和转移以及药物抗性等特点。随着宏基因组技术的飞速发展和分子生物学的广泛应用，越来越多的研究结果显示肠道微生物在结直肠癌的发生发展和转移中发挥重要作用。本研究通过收集结直肠癌患者的新鲜粪便及基本信息，采用16S rDNA高通量测序和生物信息学分析发现了结直肠癌转移患者粪便中丰度显著增加的毛螺梭菌科（ Lachnospiraceae ），并在人群样本中进行验证；构建Lachnospiraceae与结直肠癌细胞共培养模型和BALB/C-nude裸鼠肝转移模型，进一步研究Lachnospiraceae对结直肠癌细胞生物学行为、结直肠癌体内肝转移的影响。此外，我们对共培养的细胞采用 RNA-seq 高通量测序技术及 KEGG Pathway 通路富集分析，发现显著富集的糖酵解/糖异生通路；蛋白互作网络分析表明 PGK1 为该通路中 7 个蛋白的关键节点；利用qRT-PCR和WB实验验证通路中关键分子的表达，发现PGK1的表达显著上调；进一步体内、外实验探讨 PGK1 在Lachnospiraceae 促进结直肠癌转移中的作用及机制，以期为结直肠癌的预防或治疗策略的制定提供理论依据。
一、结直肠癌患者粪便肠道菌群特征分析
1. 临床样本收集及基本人口学特征分析：收集 131 例江苏省肿瘤医院行结直肠癌根治术患者的新鲜粪便。根据病人的一般情况及恶性肿瘤的TNM分期对结直肠癌患者信息进行基本人口学特征分析。所有样本均符合相应的排除和纳入标准，并经江苏省肿瘤医院及东南大学伦理委员会批准。
2. 采用Fast DNA Spin Kit for Feces（MP）试剂盒提取粪便样本细菌的总DNA；采用1 %的琼脂糖凝胶电泳对总DNA样本进行鉴定，并测定其浓度；利用特异性引物对抽提的总DNA进行PCR扩增，用2%的琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。采用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒构建文库，并对PCR扩增产物的16S rDNA的V4可变区进行测序；采用OTUs聚类分析、Alpha多样性分析、Beta多样性分析和 LEfSe 分析等方法对结直肠癌转移与非转移患者粪便微生物种类进行多样性和分类学分析及比较，发现结直肠癌转移患者粪便中丰度显著增加的Lachnospiraceae，并将其作为研究对象。
二、毛螺梭菌对结直肠癌肝转移的影响研究
1. 采用qPCR实验检测结直肠癌转移与非转移患者粪便样本中Lachnospiraceae的表达情况，结果显示，与非转移组相比，结直肠癌转移患者粪便中Lachnospiraceae的丰度显著增加（P<0.01）。
2. 将Lachnospiraceae与SW480细胞共培养，分别采用CCK8实验、EdU实验和Transwell实验检测结直肠癌细胞活力、增殖、迁移和侵袭等能力，研究Lachnospiraceae对结直肠癌细胞生物学行为的影响。细胞表型实验结果显示，Lachnospiraceae可显著增加SW480细胞的活力、增殖、迁移和侵袭能力（P<0.001, P<0.001, P<0.001, P<0.001）。
3. 构建 BALB/C-nude 裸鼠肝转移模型探讨 Lachnospiraceae 对结直肠癌转移的影响。采用活体成像技术检测小鼠结直肠癌转移情况，结果显示，单侧脾下注射SW480细胞合并灌胃 Lachnospiraceae 溶液组小鼠的肝脏荧光强度较其他各组均显著升高（P <0.001, P<0.001, P<0.001），小鼠肝脏出现多发性肿瘤；进一步采用苏木精-伊红染色法（Hematoxylin-eosin, H&E）对转移肝组织进行病理学诊断，发现相对于其他各组，单侧脾下注射SW480细胞合并Lachnospiraceae灌胃组小鼠肝脏出现明显的结直肠癌肿瘤细胞定植；采用免疫组化染色法（immunohistochemistry, IHC）检测小鼠肝组织中肠癌特异性标志物细胞角蛋白（Cytokeratin 20, CK20）的表达水平，结果显示单侧脾下注射SW480细胞合并Lachnospiraceae灌胃组小鼠肝脏组织中CK20蛋白的表达水平高于其他各组。以上结果表明，Lachnospiraceae可显著增强结直肠癌的肝脏转移能力。
三、 毛螺梭菌促进结直肠癌肝转移的分子机制研究
1. 采用 RNA-seq 高通量测序技术检测 Lachnospiraceae 与 SW480 共培养细胞的mRNA表达谱，通过差异mRNA的KEGG Pathway分析发现上调的mRNA显著富集糖酵解/糖异生通路，蛋白互作网络分析结果显示PGK1为该通路中7个蛋白的关键节点。
2. 采用 qRT-PCR 实验对糖酵解/糖异生通路的关键分子 PGK1 在 Lachnospiraceae与SW480、RKO共培养细胞中的表达水平进行验证，实验结果显示，与对照组相比，Lachnospiraceae可显著上调两种结直肠癌细胞中PGK1的表达水平（P<0.01，P<0.01）。进一步采用Western Blot实验从蛋白水平验证Lachnospiraceae对SW480、RKO中PGK1表达水平的影响，结果显示，与对照组相比，Lachnospiraceae可显著上调两种结直肠癌细胞中PGK1的蛋白表达水平 （SW480:P<0.01;RKO:P<0.01）。
3. 通过对结直肠癌细胞进行候选关键分子siRNA转染实验，在此基础上采用qRT-PCR实验检测PGK1敲减效率，采用CCK8、EdU和Transwell实验分别检测SW480、RKO细胞活力、增殖、迁移和侵袭等能力，探索PGK1对结直肠癌细胞生物学行为的影响。实验结果表明，与对照组相比，敲减PGK1可显著降低SW480、RKO细胞的活力、增殖、迁移和侵袭等能力（SW480:P<0.05, P<0.01, P<0.05, P<0.01;RKO:P<0.05, P<0.01, P<0.05, P<0.05）。
4. 构建小鼠肝转移模型，采用免疫组化染色实验观察Lachnospiraceae对PGK1表达的影响。实验结果显示，Lachnospiraceae可显著促进小鼠肝脏肿瘤组织中PGK1的表达。
综上所述，我们发现 Lachnospiraceae 在结直肠癌转移患者粪便中丰度显著增加，且 Lachnospiraceae 丰度的改变可影响结直肠癌细胞生物学行为及小鼠肝脏转移能力；敲减PGK1可显著降低结直肠癌细胞活力、增殖、迁移和侵袭能力。提示Lachnospiraceae可通过调控PGK1的表达参与糖酵解通路，从而参与调节结直肠癌转移过程。因此本研究认为，Lachnospiraceae可以作为结直肠癌肝转移的关键分子标志物，为结直肠癌肝转移的早期发现及干预提供新的研究方向。
一、结直肠癌患者粪便肠道菌群特征分析
1. 临床样本收集及基本人口学特征分析：收集 131 例江苏省肿瘤医院行结直肠癌根治术患者的新鲜粪便。根据病人的一般情况及恶性肿瘤的TNM分期对结直肠癌患者信息进行基本人口学特征分析。所有样本均符合相应的排除和纳入标准，并经江苏省肿瘤医院及东南大学伦理委员会批准。
2. 采用Fast DNA Spin Kit for Feces（MP）试剂盒提取粪便样本细菌的总DNA；采用1 %的琼脂糖凝胶电泳对总DNA样本进行鉴定，并测定其浓度；利用特异性引物对抽提的总DNA进行PCR扩增，用2%的琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。采用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒构建文库，并对PCR扩增产物的16S rDNA的V4可变区进行测序；采用OTUs聚类分析、Alpha多样性分析、Beta多样性分析和 LEfSe 分析等方法对结直肠癌转移与非转移患者粪便微生物种类进行多样性和分类学分析及比较，发现结直肠癌转移患者粪便中丰度显著增加的Lachnospiraceae，并将其作为研究对象。
二、毛螺梭菌对结直肠癌肝转移的影响研究
1. 采用qPCR实验检测结直肠癌转移与非转移患者粪便样本中Lachnospiraceae的表达情况，结果显示，与非转移组相比，结直肠癌转移患者粪便中Lachnospiraceae的丰度显著增加（P<0.01）。
2. 将Lachnospiraceae与SW480细胞共培养，分别采用CCK8实验、EdU实验和Transwell实验检测结直肠癌细胞活力、增殖、迁移和侵袭等能力，研究Lachnospiraceae对结直肠癌细胞生物学行为的影响。细胞表型实验结果显示，Lachnospiraceae可显著增加SW480细胞的活力、增殖、迁移和侵袭能力（P<0.001, P<0.001, P<0.001, P<0.001）。
3. 构建 BALB/C-nude 裸鼠肝转移模型探讨 Lachnospiraceae 对结直肠癌转移的影响。采用活体成像技术检测小鼠结直肠癌转移情况，结果显示，单侧脾下注射SW480细胞合并灌胃 Lachnospiraceae 溶液组小鼠的肝脏荧光强度较其他各组均显著升高（P <0.001, P<0.001, P<0.001），小鼠肝脏出现多发性肿瘤；进一步采用苏木精-伊红染色法（Hematoxylin-eosin, H&E）对转移肝组织进行病理学诊断，发现相对于其他各组，单侧脾下注射SW480细胞合并Lachnospiraceae灌胃组小鼠肝脏出现明显的结直肠癌肿瘤细胞定植；采用免疫组化染色法（immunohistochemistry, IHC）检测小鼠肝组织中肠癌特异性标志物细胞角蛋白（Cytokeratin 20, CK20）的表达水平，结果显示单侧脾下注射SW480细胞合并Lachnospiraceae灌胃组小鼠肝脏组织中CK20蛋白的表达水平高于其他各组。以上结果表明，Lachnospiraceae可显著增强结直肠癌的肝脏转移能力。
三、 毛螺梭菌促进结直肠癌肝转移的分子机制研究
1. 采用 RNA-seq 高通量测序技术检测 Lachnospiraceae 与 SW480 共培养细胞的mRNA表达谱，通过差异mRNA的KEGG Pathway分析发现上调的mRNA显著富集糖酵解/糖异生通路，蛋白互作网络分析结果显示PGK1为该通路中7个蛋白的关键节点。
2. 采用 qRT-PCR 实验对糖酵解/糖异生通路的关键分子 PGK1 在 Lachnospiraceae与SW480、RKO共培养细胞中的表达水平进行验证，实验结果显示，与对照组相比，Lachnospiraceae可显著上调两种结直肠癌细胞中PGK1的表达水平（P<0.01，P<0.01）。进一步采用Western Blot实验从蛋白水平验证Lachnospiraceae对SW480、RKO中PGK1表达水平的影响，结果显示，与对照组相比，Lachnospiraceae可显著上调两种结直肠癌细胞中PGK1的蛋白表达水平 （SW480:P<0.01;RKO:P<0.01）。
3. 通过对结直肠癌细胞进行候选关键分子siRNA转染实验，在此基础上采用qRT-PCR实验检测PGK1敲减效率，采用CCK8、EdU和Transwell实验分别检测SW480、RKO细胞活力、增殖、迁移和侵袭等能力，探索PGK1对结直肠癌细胞生物学行为的影响。实验结果表明，与对照组相比，敲减PGK1可显著降低SW480、RKO细胞的活力、增殖、迁移和侵袭等能力（SW480:P<0.05, P<0.01, P<0.05, P<0.01;RKO:P<0.05, P<0.01, P<0.05, P<0.05）。
4. 构建小鼠肝转移模型，采用免疫组化染色实验观察Lachnospiraceae对PGK1表达的影响。实验结果显示，Lachnospiraceae可显著促进小鼠肝脏肿瘤组织中PGK1的表达。
综上所述，我们发现 Lachnospiraceae 在结直肠癌转移患者粪便中丰度显著增加，且 Lachnospiraceae 丰度的改变可影响结直肠癌细胞生物学行为及小鼠肝脏转移能力；敲减PGK1可显著降低结直肠癌细胞活力、增殖、迁移和侵袭能力。提示Lachnospiraceae可通过调控PGK1的表达参与糖酵解通路，从而参与调节结直肠癌转移过程。因此本研究认为，Lachnospiraceae可以作为结直肠癌肝转移的关键分子标志物，为结直肠癌肝转移的早期发现及干预提供新的研究方向。