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研究背景生物治疗已经成为继手术、放疗、化疗后的第4种抗癌疗法。其中细胞过继免疫治疗是肿瘤的生物治疗的主要手段之一。治疗所采用的细胞通常来源于患者自体细胞。由于肿瘤患者一般处于免疫低功状态,有些患者很难诱导出较强的和足量的抗肿瘤免疫活性细胞。若采用MHC完全匹配的供者免疫细胞作过继免疫治疗比较理想,但供者难求。如采用MHC不相合异体免疫细胞可能会产生移植物抗宿主反应,也无法诱导针对宿主肿瘤特异性的细胞毒性T细胞(CTL)。而父母和子女之间半相合的供者较易寻找。供者免疫细胞有可能通过与患者MHC相合部分诱导产生肿瘤抗原特异性CTL；而不相合部分产生免疫佐剂效应。但应用半相合CTL进行过继免疫治疗尚缺乏深入研究。目的研究MHC半相合肿瘤特异性CTL过继免疫治疗肿瘤的效应和机制。探索细胞过继免疫治疗肿瘤的新途径。方法应用TC-1肿瘤细胞裂解物冲击C57BL/6与Balb/C的杂交一代(F1)小鼠骨髓来源的树突细胞(TP-DC),再与小鼠脾细胞混合培养,诱导肿瘤特异性CTL(TP-DC-TC); C57BL/6 (C57)荷瘤鼠以TC-1肿瘤细胞的皮下成瘤为动物治疗模型,当肿瘤直径约为5毫米时,经尾静脉回输丝裂霉素C灭活TP-DC-TC予以治疗。或用丝裂霉素C灭活的C57小鼠来源的TC-1肿瘤细胞直接免疫F1小鼠获得肿瘤特异性CTL。进而将CTL经丝裂霉素C灭活后经尾静脉输入C57小鼠TC-1肿瘤细胞人工肺转移模型。两个动物模型分别治疗3次,每次间隔5-7天,观察肿瘤大小和生存期。人工肺转移模型的小鼠末次治疗后5天,眼眶采血,用ELISA检测血浆IL-2、IL-10、IFN-γ,TGF-β水平；用流式细胞术检测脾细胞和外周血细胞中CD3+CD4+T、CD3+CD8+T、Treg、MDSC、NK等免疫细胞亚群的变化和宿主免疫效应细胞的H-2表型。组织切片检测半相合CTL治疗对心、肝、肾、脾的影响。结果ELISPOT结果显示体外或体内均可诱导半相合肿瘤特异性CTL。应用该细胞治疗皮下荷TC-1肿瘤的C57小鼠,其肿瘤生长速度减缓,生存延长。在人工肺转移C57小鼠模型中与同系小鼠CTL过继免疫治疗相比,灭活半相合CTL免疫治疗后小鼠肺表面肿瘤结节数量明显减少,小鼠的生存期显著延长。半相合CTL治疗显著上调了Thl细胞因子IL-2和IFN-γ的分泌,并下调免疫抑制因子TGF-β和IL-10产生。流式仪检测证明：半相合CTL治疗后CD4+T, CD8+T和NK细胞在外周血和脾细胞中的比例明显增高；并且诱导了宿主自身肿瘤特异性CTL和NK细胞。而Treg、MDSC细胞亚群的比例显著下降；流式检测宿主免疫细胞的H-2表型结果发现,上述免疫细胞均源于宿主自身。HE染色证实,接受半相合CTL治疗小鼠的心、肝、肾、脾的无明显的病理变化。结论灭活半相合肿瘤特异性CTL过继免疫治疗,既可特异性杀伤肿瘤,又对宿主抗肿瘤免疫起到佐剂效应。该疗法不失为一种简单、安全有效的抗肿瘤疗法。研究背景溶瘤性单纯疱疹病毒(OncolyticHSV,简称为oHSV)具有强效、特异、广谱、安全及易于生产制备等特点。oHSVl已进入临床Ⅰ-Ⅲ期试验阶段。虽有文献报道oHSV2对肿瘤细胞的杀伤活性比oHSVl强,在治疗动物膀胱癌以及卵巢癌腹腔转移时,疗效明显好于oHSVl,但对oHSV2的研究较少。另外,oHSV作为载体还可以携带各种治疗性基因(如GM-CSF, TNF-α、药物前体转化酶、IL-12、FGFR2-IIIb, TRP1等),因此,我们已构建成有自主知识产权的新型oHSV2hGM-CSF,以改进病毒的安全性(优于现有的oHSV2)及增强病毒的溶瘤活性(优于现有的oHSVl),同时具有佐剂效应,增强机体抗肿瘤免疫。目的构建新的含有表达人GM-CSF的溶瘤2型疱疹病毒(oHSV2hGM-CSF),初步验证其体外溶瘤效果及其对小鼠B16R黑色素瘤模型的体内疗效。方法采用PCR、分子克隆及同源重组技术,从HG52野生病毒株的基因组中剔除ICP34.5及ICP47基因并插入hGM-CSF表达序列,构建hGM-CSF溶瘤活性体外实验,将HeLa, Eca-109和PG等16种肿瘤细胞分别接种到24孔板,分别用oHSV1hGM-CSF和oHSV2hGM-CSF (MOI=1)感染24h、48h后,显微镜观察细胞病变。动物实验,以表达HSV感染受体的C57BL/6小鼠黑色素瘤细胞B16R为模型。当肿瘤生长至直径约7-8mm3时,瘤内分别注射2.3 X106 PFU oHSV1hGM-CSF和oHSV2hGM-CSF,共3次,每次间隔3天,同时测量肿瘤大小,并观察生存期。结果PCR扩增及DNA序列分析证实各目的基因被剔除及hGM-CSF表达盒插入到ICP34.5的基因位点。oHSV1hGM-CSF和oHSV2hGM-CSF MOI-1感染肿瘤细胞后,24h即能观察到细胞病变,且溶瘤谱较广,oHSV2hGM-CSF感染的肿瘤细胞合胞体现象比较多。从感染48h的图像来分析,oHSV2hGM-CSF对HeLa, HepG2、SK-Mel-28 B16R U87-MG,的溶瘤效果优于oHSV1hGM-CSF。B16R细胞的黑色素瘤的动物实验发现,接受oHSV2hGM-CSF治疗后,能明显延长治疗组荷瘤鼠的生存期(P<0.01)；减缓肿瘤的生长(oHSV1hGM-CSF组, P<0.05; oHSV2hGM-CSF组, P<0.01)。结论oHSV2hGM-CSF对人肿瘤细胞溶瘤谱较广,对荷B16R黑色素瘤瘤内注射有较好的抗肿瘤效应,具有较好的开发前景,有望成为临床治疗肿瘤的制剂。