[目的]1.采用MTT比色法来检测益气解毒方不同有效部位对鼻咽癌细胞CNE2的抑瘤作用,初步筛选该方抗鼻咽癌的有效部位。2.观察益气解毒方乙酸乙酯提取物(EAE)对荷鼻咽癌细胞移植瘤裸鼠的抑瘤效率及其对肿瘤微环境DC功能相关细胞因子分泌活性的影响,进一步确定益气解毒方乙酸乙酯提取物干预鼻咽癌肿瘤微环境DC的药学效应。3.观察益气解毒方有效部位乙酸乙酯提取物对鼻咽癌患者外周血树突状细胞分化发育及T细胞活化的干预效应,确定该提取物对鼻咽癌患者DC相关抗肿瘤免疫病理学学的影响。[方法]第一部分益气解毒方不同极性部位的提取及其抗鼻咽癌活性的研究采用不同的溶剂将益气解毒方分离为不同的极性部位,然后应用MTT比色法测定该方各个提取部位的抑瘤效应。第二部分益气解毒方乙酸乙酯提取物对鼻咽癌细胞裸鼠移植瘤微环境DC相关免疫病理学的干预效应研究1.鼻咽癌CNE2细胞的常规培养2.在BALB/c裸鼠制备CNE2细胞移植瘤模型3.将荷瘤裸鼠随机分为四组：模型组、益气解毒方乙酸乙酯提取物组(EAE组)、顺铂(DDP)组和联合治疗(EAE+DDP)组,干预处理12d后,期间观察裸鼠的一般行为状况的变化,然后处死裸鼠,获取组织标本,检测相关指标。4.比较各组荷瘤裸鼠的抑瘤率。5.用SABC免疫组化法检测比较各组移植瘤组织中IL-12和MHC-Ⅱ的蛋白表达含量。6.采用ELISA法检测比较各组移植瘤组织中IL-4、IL-12和IFN-γ的水平含量。7.运用RT-PCR法检测比较各组移植瘤组织中IL-4、IL-12和IFN-γ的基因表达水平。第三部分益气解毒方乙酸乙酯提取物对鼻咽癌患者外周血体外诱导之DC相关功能的干预效应研究1.无菌分离鼻咽癌患者外周血单个核细胞(PBMC),应用重组人粒细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)和重组人白介素-4(rhIL-4)体外诱导生成DC,同时在培养液中加入不同浓度的益气解毒方乙酸乙酯提取物(100μg/ml,200μg/ml),并设立生理盐水(NS)对照组,以观察DC的形态特征及功能变化。2.在DC培养的第7d,收集并调整细胞密度,应用流式细胞仪检测其表面标志物CDla、CD86和HLA-DR的表达情况。3.收集每次换下的培养上清液,采用ELISA法检测其中的细胞因子IL-12水平动态变化。4.应用MTT比色法检测经益气解毒方EAE刺激后DC诱导的CTL对鼻咽癌细胞CNE2的杀伤效率[结果]第一部分益气解毒方不同极性部位的提取及其抗鼻咽癌活性的研究益气解毒方经溶剂提取法制备,获得了多糖提取部位、乙酸乙酯提取部位和乙醇提取部位。多糖和乙醇提取部位无明显的抑瘤作用；乙酸乙酯提取物在100μg/ml已具有明显的抑瘤作用,且抑瘤率与药物剂量呈明显的正相关关系。第二部分益气解毒方乙酸乙酯提取物对鼻咽癌细胞裸鼠移植瘤微环境DC相关免疫病理学的干预效应研究1.各处理组动物的一般情况比较模型动物观察过程中,精神状态好,活动自如,摄食和饮水正常、大小二便正常,期间无明显不良反应。EAE组裸鼠未见明显的药物毒副反应,精神状态好,对刺激反应明显,生存质量好；其次为联合治疗组；再次为模型组；DDP组药物毒副反应明显,拱肩缩背、行动缓慢、体态倦怠等表现,生存质量最差。2.益气解毒方有效部位EAE、DDP及联合用药都可以明显提高荷瘤裸鼠的抑瘤率,但EAE联合DDP对移植瘤具有更好的协同抑瘤作用。3.免疫组化法检测结果显示：与模型对照组比较,EAE组、DDP组和联合用药组移植瘤组织中IL-12、MHC-Ⅱ蛋白表达水平升高,差异的统计学意义显著(P<0.01)。与EAE组比较,DDP组中IL-12、MHC-Ⅱ蛋白表达水平降低,而联合用药组中IL-12、MHC-Ⅱ蛋白表达水平升高,差异具有统计学意义(P<0.01)。4.各组裸鼠移植瘤组织中IL-4、IL-12、IFN-γ水平含量比较经不同药物对各组移植瘤模型进行处理后,EAE组、DDP组和联合治疗组移植瘤组织匀浆上清液中IL-12、IFN-γ含量水平均增加,而IL-4含量水平降低,与模型组相比,差异具有统计学意义(P<0.01)。与EAE组比较,DDP组上清液中IL-12、IFN-γ水平含量水平降低,IL-4含量水平升高,联合治疗组上清液中IL-12、IFN-γ水平含量水平升高,IL-4含量水平降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。以上结果说明,益气解毒方乙酸乙酯提取物和DDP均能增加鼻咽癌细胞移植瘤微环境中IL-12、IFN-γ含量水平,降低IL-4含量水平,但益气解毒方EAE单用的效果优于DDP,而两者联合运用则能更有较地调节鼻咽癌细胞移植瘤微环境中Th1与Th2相关因子的含量水平变化趋势,有利于克服肿瘤微环境中的免疫耐受现象。5.肿瘤组织IL-4、IL-12、IFN-γ基因表达水平比较经药物干预后,与模型对照组比较,EAE组和联合治疗组中IL-12、IFN-γ基因表达水平增加,IL-4基因表达水平降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。EAE组与DDP组比较,IL-12、IFN-γ基因表达水平增加,IL-4基因表达水平降低；EAE组与联合治疗组相比,后者IL-12、IFN-γ基因表达水平增加,IL-4基因表达水平降低更加显著,其差异都具有统计学意义(P<0.01)。以上结果说明益,气解毒方乙酸乙酯提取物能增加IL-12、IFN-γ基因表达水平,降低IL-4的基因表达水平,其变化趋势与鼻咽癌细胞移植瘤微环境中相应细胞因子表达活性相似,能够有效提高肿瘤微环境中的细胞免疫效应机制,而且也提示联合治疗组效果更加显著。第三部分益气解毒方乙酸乙酯提取物对体外诱导之鼻咽癌患者外周血DC相关功能的干预效应研究1.益气解毒方EAE可以促进体外诱导之鼻咽癌患者外周血DC分化及成熟,培养第1d后即可见大部分细胞贴壁,许多细胞聚集并均匀分散形成细胞集落。第2～3d可见细胞有少量短突起,部分细胞不规则,部分细胞开始呈现半悬浮和悬浮状态。第4d后高剂量组中可见大部分细胞有突起伸出交织在一起,低剂量和NS组有部分细胞伸出突起。第7d低、高剂量中的细胞变大变圆,大部分DC从贴壁变成悬浮状态,而NS组中的细胞密度较低,且悬浮的细胞也较少。2.益气解毒方EAE能增加DC表面CD1a、CD86和HLA-DR的表达,高剂量组作用显著,与对照组相比统计学意义非常显著(P<0.01)。3. ELISA法检测第2d、第4d和第6d的培养上清液,结果发现IL-12的含量随着培养天数的增加而升高。低浓度和高浓度益气解毒方EAE组中IL-12浓度均比NS对照组明显增高(P<0.01)；与低浓度组相比,高浓度EAE组中IL-12浓度也明显增加,差异具有统计学意义4.益气解毒方EAE能促进体外诱导之鼻咽癌患者外周血DC的成熟,提高DC诱导的CTL对CNE2细胞的杀伤活性,具有剂量效应关系,与NS对照组相比具有统计学意义(P<0.01)。[结论]1.乙酸乙酯提取部位为益气解毒方抗鼻咽癌的有效部位；2.益气解毒方EAE对鼻咽癌细胞裸鼠移植瘤具有较强的抑瘤作用,联合运用顺铂能进一步增强其抑瘤率,有效提高荷瘤裸鼠治疗后的生存质量。3.益气解毒方EAE联合顺铂能有效提高免疫活性细胞MHC-Ⅱ、IL-12和IFN-y的含量及其基因表达水平,降低IL-4的含量及基因表达水平,促使肿瘤微环境中Th1/Th2系统分化活性向Th1方向漂移,从而有利于改善肿瘤微环境中免疫耐受现象,促进抗肿瘤免疫效应。4.益气解毒方EAE能有效刺激体外诱导之鼻咽癌患者外周血DC的分化成熟,增加DC表面的CD1a、CD86和HLA-DR的阳性表达；促进DC的IL-12分泌活性；经益气解毒方EAE激活的DC,能增强T细胞的增殖反应,强化CTL对鼻咽癌靶细胞的杀伤活性。5.益气解毒方EAE可能通过调节鼻咽癌肿瘤微环境中DC的功能功能状态,提高其肿瘤抗原递呈能力,从而促进荷瘤机体对肿瘤发挥细胞免疫应答。