论文部分内容阅读
淋巴囊肿病毒中国分离株(Lymphocystis disease virus isolated from China, LCDV-C)和蛙虹彩病毒(Rana grylio virus, RGV)是我国分离到的水产动物重要病毒病原,分别来自患病牙鲆和美国青蛙。在实验室对LCDV-C全基因组进行测定和序列注释以及对RGV理化性质鉴定的基础上,本文对LCDV-C三个免疫逃避蛋白基因进行了克隆和功能检测,并对RGV诱导凋亡的机制进行了研究,具体结果如下:1.通过同源性搜索表明:LCDV-C编码三个免疫逃避蛋白基因同源框:G蛋白耦联受体(G protein coupled receptor,GPCR)(ORF124R)、肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor,TNFR)(ORF095R)以及一个Bcl-2基因(ORF189R)。并对以上三个基因进行特征分析。(1)利用跨膜分析显示,LCDV-C GPCR编码一个具有典型七次跨膜结构域的受体蛋白,并有一个高度保守的DRY模体。通过氨基酸同源性搜索显示LCDV-C GPCR和牙鲆编码的趋化因子受体CCR9具有高达37%的同源性,比哺乳动物以及哺乳动物病毒编码的趋化因子受体同源性略高。以LCDV-C基因组为模板,设计特异引物扩增得到LCDV-C GPCR全长,构建融合蛋白GPCR-GFP和GPCR-pcDNA3.1,在细胞水平进行了亚细胞定位和功能的检测。结果表明:LCDV-C GPCR在鱼类细胞EPC和FHM中表达具有泛细胞分布的特征。瞬时过量表达对鱼类细胞没有明显的毒性影响。稳定表达LCDV-C GPCR的FHM细胞在正常的细胞培养条件下,能够促进细胞的增殖;在软琼脂培养条件下,LCDV-C GPCR表达的细胞具有失去定着依赖性生长的典型特征。对LCDV-C GPCR表达的FHM细胞进行不同浓度的放线菌酮(CHX)和放线菌素D(ActD)诱导,结果显示LCDV-C GPCR表达细胞在ActD诱导之后的凋亡小体数目比对照细胞要少;且流式细胞仪检测证实LCDV-C GPCR的表达能够明显抑制ActD和CHX诱导的凋亡。LCDV是一种能够长期潜伏感染鱼类、引起肿瘤发生的病毒,因此可推测,GPCR抑制凋亡、转化细胞是LCDV-C致肿瘤的一种重要途径。(2)经计算机辅助分析表明,LCDV-C Bcl-2和斑马鱼Mcl的同源性达到34%,并且C端具有一个跨膜区域。通过构建LCDV-C Bcl-2的GFP融合蛋白,进行显微观察表明,LCDV-C Bcl-2和内质网完全共定位,而其跨膜缺失突变体的定位则发生了变化,揭示跨膜区对于LCDV-C Bcl-2的内质网定位是必需的。细胞毒性检测试验表明,LCDV-C Bcl-2的瞬时表达不诱导FHM细胞出现凋亡,但是其稳定表达能促进ActD诱导的凋亡,而跨膜区的缺失对促进凋亡作用有一定的影响。此外,LCDV-C Bcl-2过量表达还能抑制ActD诱导凋亡过程中核转录因子NF-κB的激活。(3)对LCDV-C TNFR的结构域分析表明,其N端是肿瘤坏死因子家族所含有的半胱氨酸富集区。LCDV-C TNFR和淋巴囊肿病毒欧洲株LCDV-1、LCDV-2编码TNFR类似物的同源性都低于20%,显示虹彩病毒不同分离株之间基因结构存在差异。通过GFP融合蛋白的亚细胞定位结果显示,LCDV-C TNFR主要分布在内质网,与已知病毒编码TNFR类似物的表达定位明显不同。体外细胞毒性试验表明,LCDV-C TNFR的过量表达不诱导鱼类细胞出现凋亡,但是能促进ActD和CHX诱导的凋亡,并能抑制ActD诱导凋亡过程中转录因子NF-κB的激活。2.利用电镜及荧光显微镜观察、报告基因检测、细胞内钙离子浓度变化以及caspase活性测定等方法,研究RGV感染引起细胞凋亡的机制。结果表明RGV感染能够引起FHM细胞出现线粒体的片断化、caspase-9的激活、核转录因子NF-κB和AP-1的激活以及细胞质内钙离子浓度升高等变化。结合对RGV感染能够引起线粒体的细胞分布发生变化以及线粒体膜电势升高的认识,提出RGV诱导的凋亡是线粒体介导的见解,并绘制出RGV诱导细胞凋亡的模式图。本文的研究结果不仅为在分子水平上研究虹彩病毒的免疫逃避以及病毒与宿主细胞的相互作用积累重要信息,而且为进一步了解虹彩病毒的致病机理奠定坚实的基础。