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第一部分：绿茶多酚对高糖高脂大鼠模型糖代谢的影响 目的:通过建立高脂高糖饮食大鼠模型,以不同剂量的茶多酚进行干预,观察其对大鼠体重,甘油三酯,胆固醇,血胰岛素,HMOA-IR,低密度脂蛋白及高密度脂蛋白的影响。 方法:购入SPF级雄性wistar大鼠适应性喂养10天后,按体重,基础指标(GL,TG,CHO)水平测定分为五组:正常对照组(CON),喂以基础饲料;高糖高脂对照组(HG),喂以自行配制的高糖高脂饲料;茶多酚三个剂量实验组(100mg/kg.bw,200mg/kg.bw,400mg/kg.bw),喂以高脂饲料的同时给予添加溶有茶多酚的饮水,每组10只,共50只。各组大鼠予每周称重,每月采血进行体重和指标监测,于喂养35周后处死收集血清样本。大鼠甘油三酯,胆固醇,低密度脂蛋白,高密度脂蛋白,空腹血糖测定采用ELX800型酶标仪测定,空腹血胰岛素测定采用放射免疫方法,HOMA-IR具体操作步骤按试剂盒说明进行。 结果:(1)与CON组比较,从第12周开始,HG组大鼠体重显著增加,且随着喂养天数的增加,体重差距呈逐渐增大趋势。大鼠血清TG,CHO,LDL都明显升高(P<0.05),而在茶多酚各组均观察到下降趋势,其中茶多酚高剂量组差异具有显著性(P<0.05)。同时,HG组高密度脂蛋白明显降低,茶多酚干预后有回升趋势,但差异没有显著性 (2)HG组空腹血糖,血胰岛素和HOMA-IR指数都较CON组明显升高(分别升高15.73％,28.51%,53.53%)差异均有显著性。茶多酚各剂量组较HG组均有下降趋势,其中除血胰岛素没有明显差异外,空腹血糖和HOMA-IR指数差异明显。(高剂量组分别下降15.95%,25.52%,P<0.05)。 结论:(1)各项基础指标测定结果表明高糖高脂大鼠代谢综合征(MS)模型建造成功,与代谢相关的血脂血胆固醇在高糖组均显著增高,对心血管疾病早期模型具有参考价值。 (2)饮水中加入茶多酚后对高糖高脂饮食诱导的血脂血胆固醇升高具有下调作用,并能有效改善高糖组的胰岛素敏感性,一定程度上抵制胰岛素抵抗的发生。 第二部分：绿茶多酚对大鼠心脏ROS及NO合酶活性的影响 目的:通过观察绿茶多酚对高糖高脂饮食大鼠心肌组织ROS水平和iNOS的活性变化,进一步提供体内实验数据。 方法:35周末将所有大鼠过夜禁食12h后,于次日断头处死,收集全血及心脏组织,制作冰冻切片用于ROS荧光检测,血清用于iNOS活性检测。 结果:(1)HG组与CON组比较iNOS活性上调43.7%,GTP各处理组的iNOS活性与HG组比较均有显著性差异(P<0.05),其中高剂量组下调45.89%。 (2)HG组与CON比较ROS活性明显升高(15.4%),GTP各处理组的ROS活性与HG组比较有下调趋势,其中GH组下调效果最为明显(8.7%)。 结论:茶多酚能有效降低高糖高脂诱导MS大鼠模型体内ROS,iNOS活性水平,改善体内由于过多的ROS和NO积聚反应而引起的更为严重的损伤。 第三部分：绿茶多酚对大鼠心脏Hsp90及caveolin-1基因及蛋白表达的影响 目的:在已观察到茶多酚对MS大鼠模型具有保护效应的基础上,观察大鼠心肌组织caveolin-1和Hsp90的表达差异,以求探索其改善心血管血脂代谢紊乱的调控机制。方法:分离大鼠心脏组织,用于冰冻切片制作与RNA,蛋白提取。实时定量聚合酶链反应(real-time PCR)检测各组大鼠心肌组织Hsp90和caveolin-1基因表达水平;免疫印记法(Western Blot)检测各组大鼠心肌组织Hsp90和caveolin-1蛋白表达水平;免疫组化(Immunohistochemistry)对Hsp90和caveolin-1进行蛋白定位和半定量检测。 结果:(1)RT-PCR结果显示茶多酚可以逆转高糖高脂诱导的Hsp90mRNA的下降(273.3%)及caveolin-1mRNA的升高(90.54%),差异具有显著性(P<0.05)。 (2)Western Blot结果显示茶多酚可以逆转高糖高脂诱导的Hsp90蛋白表达的下降及caveolin-1表达的升高(47.98%),差异具有显著性(P<0.05)。同时Immunohistochemistry结果与其表现出相似趋势,但差异无显著性。 结论:NOS的主要调节蛋白Hsp90和caveolin-1无论基因还是蛋白都呈现相反的表达趋势,推测茶多酚可能在转录和翻译水平上都影响了此两种蛋白的合成与降解,从而实现对NOS生理功能的调控。 第四部分：绿茶多酚对培养内皮细胞中ROS,iNOS,Hsp90及caveolin-1蛋白表达的影响 目的:通过构建体外相似模型,观察绿茶多酚对高浓度葡萄糖培养的血管内皮细胞NOS活性的调节及其主要调控蛋白Hsp90和caveolin-1的表达影响。 方法:采用0.4μg/ml和4.0μg/ml的绿茶多酚干预高糖(33mmol/L)刺激的血管内皮细胞,培养24h后用荧光探针DCFH-DA测定细胞内的ROS释放水平,同时采用NOS试剂盒测定各组eNOS,iNOS活性水平,WesternBlot测定各组iNOS,Hsp90和caveolin-1的蛋白表达。 结果:绿茶多酚处理组显著降低内皮细胞内由高糖诱导的ROS水平及iNOS的活性,高剂量组分别下调48.91%与81.71%(P<0.05),WesternBlot显示绿茶多酚可以缓解甚至逆转由高糖刺激导致的内皮细胞iNOS表达降低61.17%(P<0.05),同时NOS的调控蛋白Hsp90与caveolin-1表达同之前体内实验结果基本一致。 结论:茶多酚可能是通过影响NOS的主要调控蛋白Hsp90和caveolin-1的表达从而降低高糖环境下内皮细胞iNOS的活性与上调eNOS来平衡内皮细胞内的NO水平,同时减少ROS的生成继而防止其后进一步的氧化损伤。 创新之处: 1.首例研究了高糖高脂饮食诱导的大鼠心血管疾病早期模型心脏组织中caveolin-1与Hsp90的表达差异,并研究其在NO合酶信号转导中的作用,对相关疾病的发病机制和进展研究具有重要意义。 2.尝试运用饮水方式添加黄酮类植物化学物茶多酚并获得成功,为建造动物模型提供新方法。鉴于茶多酚的降糖、降脂、抗氧化作用,为其对心血管疾病早期预防作用的研究开辟新思路,具有新颖重要的理论现实意义,迄今国内外未见报道。