目的:谷氨酸(Glu)的兴奋毒性作用是创伤性脑损伤(Traumatic brain injury,TBI)的重要分子机制。深入研究Glu受体亚单位及其突触内、外受体组合结构的变化,受体的转运、表达和再聚合的调控过程,对于深化认识TBI的发病机制具有重要理论意义。新近研究表明,第10染色体同源丢失性磷酸酶张力蛋白基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten,PTEN)参与Glu受体的代谢,从而调控Glu的兴奋毒性,加重TBI。例如:PTEN可以调节Glu受体-N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体磷酸化过程,导致NMDA受体兴奋性增加,从而致使Glu作用下细胞内Ca2+超载和神经元凋亡。但PTEN对Glu的另一离子通道型受体,α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(AMPA)受体的调节是否存在类似作用尚不清楚,有待深入研究。AMPA受体是由四种分别由不同基因编码的亚基,GluR1,2,3,4组成,其中GluR2亚基由于其mRNAQ/R位点编辑引起的低钙离子通透性,使得它在AMPA受体中的相对含量决定了AMPA受体的功能特性。GluR2亚基在多种神经元中高表达,这使得钙离子不能通过AMPA受体内流。因此,GluR2可能是PTEN调控AMPA受体代谢的重要靶点。方法:本研究选用新生SD大鼠原代培养海马神经元,建立神经元牵张损伤模型,采用Western-blot和Tunel染色检测神经元损伤各时相点PTEN表达的变化以及AMPA受体各亚基在细胞中的表达定位变化。利用RNAi慢病毒载体敲减神经元中PTEN基因的表达,评估PTEN对大鼠原代海马神经元牵张损伤后AMPA受体GluR2亚单位定位表达的调节作用以期为PTEN作为预防和治疗TBI靶点的临床策略提供实验依据。结果:1.海马神经元损伤后PTEN表达水平与AMPA受体亚基表达定位变化的关系(1)大鼠原代海马神经元牵张损伤后,随着时间的推移,凋亡细胞数量比例逐渐增多。(2)神经元牵张损伤后,PTEN的表达水平增高,2h损伤组PTEN表达水平较未损伤组显著增高(P < 0. 05)。损伤24h组PTEN表达水平达到顶峰,损伤48h组PTEN表达水平较损伤24h组低。(3)牵张损伤0h、2h、6h、24h、48h后,利用Western-bolt检测大鼠原代海马神经元总蛋白中AMPA受体GluR1、GluR2、GluR3亚基的表达水平。结果显示各个组中GluR1、GluR2和GluR3的表达水平无明显的统计学差异。(4)Western-bolt检测结果显示牵张损伤各时间点大鼠海马神经元膜蛋白中GluR1和GluR3亚基的表达水平无明显的统计学差异。但细胞膜中的AMPA受体GluR2亚基在牵张损伤6h、24h、48h后明显降低。2.慢病毒介导的PTEN siRNA对大鼠原代海马神经元牵张损伤后AMPA受体GluR2亚单位定位表达的调节作用(1)慢病毒介导的PTEN siRNA能够有效敲减大鼠原代海马神经元中PTEN的表达。(2) Neuron组牵拉损伤2h后,可见神经元胞体肿胀。牵拉损伤6h后:可见神经元胞体皱缩,部分细胞连接断裂,细胞网络变稀疏。牵拉损伤24h后,可见神经元胞体皱缩明显,大部分细胞连接断裂,细胞仍贴壁,但可见许多悬浮死细胞,细胞数量略有减少,细胞网络消失。牵拉损伤48h后,可见神经元细胞数量明显减少,可见变性的神经元细胞及细胞碎片。Neuron-PTEN-ND组在牵张损伤0h、2h和6h形态变化和Neuron组基本一致,牵拉损伤24h和48h后细胞损伤情况明显较Neuron组轻。Turnel染色证实,两组细胞在0h、2h和6h凋亡比例无明显差异,但Neuron-PTEN-ND组在24h和48h凋亡比例明显低于Neuron组。(3) Western-bolt检测结果显示,牵张损伤各时相点,Neuron-PTEN-ND组和Neuron组总蛋白中AMPA受体GluR2亚单位的含量均无明显的统计学差异。Neuron组细胞膜中的AMPA受体GluR2亚单位含量在牵张损伤6h、24h、48h明显降低。Neuron-PTEN-ND组细胞膜中的AMPA受体GluR2亚单位含量在牵张损伤6h无明显降低,牵张损伤24h、48h后降低。细胞损伤6h、24h、48h,Neuron-PTEN-ND组细胞膜中的AMPA受体GluR2亚单位含量明显高于Neuron组。结论:海马神经元受到机械性牵张损伤后,细胞内PTEN水平与膜表面GluR2亚基表达变化相反。提示PTEN磷酸酶可能参与了AMPA受体中GluR2亚基的转运和再聚合过程。下调PTEN的表达能够有效地阻止AMPA受体GluR2亚单位在细胞膜上定位的降低,降低凋亡细胞比例。PTEN对AMPA受体的调节作用可能为临床上预防和治疗脑创伤提供一条新途径。