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背景和目的:细胞毒素(Cadiotoxins CTXs)是眼镜蛇毒中一类重要的活性蛋白,约占蛇毒总蛋白含量40%左右,它们的氨基酸序列和空间结构相当保守,但生物学活性却多种多样,如引起可兴奋性组织去极化[1]、溶解肿瘤细胞[2]、心脏毒性[3]和抗菌活性[4]等。不同地区、不同蛇种的蛇毒中含有不同的CTXs,且即使是同种蛇毒中也含有2～5个CTXs,它们的结构及生物学活性有一定差异[5] [6],对它们的结构与功能的研究是当今生物毒素研究的热点之一。本课题运用CM-Sepharose FF阳离子交换凝胶柱层析一步法对舟山眼镜蛇蛇毒分离纯化,以提高分离效率和纯度;利用RP-HPLC内标法鉴定分离得到的单体;CTXs具有广泛的生物活性,如镇痛、抑制肿瘤增殖等,本研究利用热板法和醋酸扭体法初探CTX1的镇痛活性。利用125I同位素标记法观察在生理条件下和吗啡成瘾条件下,研究CTX1在体内的分布情况,对比两种情况下其脑组织内的分布情况,以考察在不同病理生理条件下,CTX1在血脑屏障的通透性。为进一步研究CTX1的药理作用打下基础。方法:一、舟山眼镜蛇毒CTX1层析分离的流速优化1.一步法对舟山眼镜蛇蛇毒进行纯化分离收集舟山眼镜蛇原毒样本,经采集处理后,运用CM-Sepharose FF阳离子交换凝胶柱层析,研究不同洗脱速度对蛇毒蛋白分离纯化的影响。2. Sephadex G-25层析洗脱脱盐利用分子筛原理,将洗脱峰内含有的蛇毒蛋白和盐溶液洗脱分离。研究不同洗脱速度对脱盐效率和结果的影响。3.舟山眼镜蛇毒单体成分的鉴定采用RP-HPLC,内标法鉴定分离纯化的舟山眼镜蛇蛇毒单体,与标准品比较保留时间,确定分离单体的成分。二.CTX1的毒性及镇痛活性测定1.急性毒性实验Bliss法检测CTX1的LD50。通过预实验确定100%致死量和0%致死量。由高浓度开始,药物浓度依次稀释0.8倍,共设5个浓度梯度。给药后观察48h,记录死亡时间和中毒症状。2.急性疼痛实验运用热板实验和醋酸扭体实验测定CTX1对生理性疼痛的镇痛作用。三.CTX1的体内分布及对不同模型小鼠血脑屏障的通透性1.小鼠吗啡成瘾模型的建立采用吗啡剂量递增法建立小鼠吗啡成瘾模型,腹腔注射纳洛酮,观察小鼠的戒断症状以及体重变化,评价成瘾模型的是否成功。2. 125I同位素标记CTX1采用氯胺酮氧化法,将CTX1标记125I,利用Sephadex G-50分子筛将标记与未标记的125I分离;纸层析法检验125I的标记率。3.小鼠尾静脉注射125I- CTX1,不同的时间点取各脏器,检测cpm值,以比较CTX1在体内的分布情况;通过两种模型的对比,研究CTX1在不同病理生理条件下,通过血脑屏障的能力。四.统计分析采用t检验、χ2检验,SPSS软件等统计分析实验数据。结果:1.运用CM-Sepharose FF阳离子交换凝胶柱层析一步法对舟山眼镜蛇蛇毒分离纯化,流速V=1.6ml/min时,分离结果理想,得到高纯度的蛇毒单体。2.运用RP-HPLC法,将分离的组分SV6与CTX1内标法对比,结果保留时间一致,判断组分SV6与CTX1为同一成分(注:文中用CTX1表示组分SV6)。3. CTX1急性毒性和镇痛活性的测定结果显示CTX1的LD50为4.33±0.56 mg/kg。CTX1具有良好的镇痛活性,具有剂量依赖性,治疗指数高。4.在生理条件下,CTX1在肾脏的分布最高,脑部的分布量很少;在吗啡成瘾模型条件下,CTX1在脑内的分布量明显增加。结论:1.舟山眼镜蛇原毒经CM-Sepharose FF阳离子交换凝胶柱层析分离得到高纯度单体,洗脱流速为1.6ml/min时分离效果最佳。2. CTX1具有镇痛作用,且呈剂量依赖性。3. CTX1在生理条件下,较少通过血脑屏障;在吗啡成瘾模型小鼠,能明显通过血脑屏障。