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研究目的: 检测微小RNA-126(MicroRNA-126,miR-126)在CD4+CD25+调节性T细胞(regulatoryTcells,Tregs)中的表达水平,同时构建基于慢病毒的miR-126反义寡核苷酸序列(antisenseoligonucleotides,ASOs)表达载体,研究重组的病毒对Tregs外周诱导的作用,为进一步研究miR-126对Tregs的生物学功能的调控作用和机制奠定基础。 研究方法: 实时定量PCR特异性探针法检测miR-126在Tregs中的表达水平;针对miR-126序列,设计合成其ASOs序列,退火后连接至经AgeI酶和EcoRI酶双酶切的pGCsil-LV-GFP载体上,连接产物转化DH5α感受态细胞,对经PCR鉴定为阳性的载体(命名为pGCsil-miR-126-ASOs)进行测序分析;将构建成功的pGCsil-miR-126-ASOs表达质粒和pHelper1.0、pHelper2.0质粒共转染293T细胞,浓缩病毒颗粒并测定所获病毒滴度;将制备好的病毒颗粒感染TGF-β体外诱导培养的小鼠CD4+CD62L+初始T细胞,72h后用流式细胞仪检测其Foxp3的表达变化。 研究结果: 实时定量PCR结果显示miR-126在Tregs中的表达明显高于CD4+CD25-T细胞(P<0.01);测序结果证明成功构建pGCsil-miR-126-ASOs重组质粒载体,包装并获得高浓度的慢病毒颗粒,病毒滴度为9×108TU/mL;重组的病毒能明显抑制Tregs的外周诱导(P<0.05)。 结论: 成功构建miR-126ASOs的慢病毒表达载体,并获得高浓度的病毒颗粒,为进一步研究miR-126对Tregs的生物学功能的调控作用和机制奠定基础。