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目的利用膜蛋白酵母双杂交系统筛选与中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood bee virus,CSBV)结构蛋白VP1相互作用的宿主蛋白,并对其验证及其在病毒复制中的作用进行初步研究,为深入了解CSBV致病机制奠定理论基础。方法将CSBV结构蛋白基因VP1插入至p BT3-STE载体中,构建诱饵质粒p BT3-STE-VP1,然后将诱饵质粒与对照质粒转化到酵母感受态细胞NMY32中进行自激活与功能验证。在此基础上,将p BT3-STE-VP1质粒与中蜂幼虫膜蛋白酵母c DNA文库质粒共转至酵母菌NMY32中,分别置于SD-TL、SD-TLH+60 m M3AT培养基上进行筛选,初步获得阳性克隆。用p PR3N特异性引物对阳性克隆菌进行PCR扩增并测序,测序结果进行BLAST比对分析,获到23个宿主相关蛋白。参考相关文献和报道,选择热休克蛋白70(Hot shock protein 70,Hsp70)作为研究对象,通过Glutathione S-transferase(GST)pull down和免疫共沉淀(Co-IP)技术对CSBV VP1与Hsp70之间的互作进行验证。构建真核重组质粒p EGFP-C2-Hsp70-Flag,并将p TT5-VP1-His和p EGFP-C2-Hsp70-Flag共转染至HEK293T细胞中,利用激光共聚焦显微镜对Hsp70与VP1在细胞内共定位进行观察;通过实时定量PCR(real-time polymerase chain reaction,RT-P CR)和western blot方法对健康幼虫和感染CSBV幼虫体内Hsp70表达情况进行检测,分析CSBV感染前后Hsp70表达量的变化。在此基础上,我们针对Hsp70设计3对si RNA,选择出对Hsp70沉默效果较好的si RNA进行后续干扰试验,初步分析Hsp70在CSBV感染中的作用。结果本研究成功构建诱饵质粒p BT3-STE-VP1并将其转入酵母感受态细胞NMY32中。通过自激活与功能验证证明,诱饵质粒p BT3-STE-VP1无自激活能力,且在酵母细胞中能够正常表达。p BT3-STE-VP1与中华蜜蜂幼虫c DNA文库互作,筛选得到与CSBV VP1蛋白相互作用的23种宿主蛋白,这些蛋白质在机体中发挥重要作用,例如应激反应、蛋白磷酸化、信号转导、蛋白靶向、细胞骨架组织、DNA修复、蛋白质调节、核糖体代谢等。通过综合分析并查阅相关文献,Hsp70在病毒合成和机体的抗病毒免疫方面扮演重要角色,因此我们选择Hsp70进行后续实验。通过GST pull down和Co-IP技术证明Hsp70与VP1存在相互作用,利用激光共聚焦显微镜观察到Hsp70与VP1蛋白共定位于细胞核和细胞质。通过实时定量PCR(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)和western blot,在CSBV感染后幼虫体内Hsp70表达量明显上调。在此基础上,通过si RNA干扰实验沉默了Hsp70后,CSBV拷贝数明显下调。结论1、CSBV VP1与Hsp70存在相互作用,并且VP1和Hsp70共定位于细胞质和细胞核中。2、当幼虫感染CSBV后能够引起Hsp70表达明显上调。当Hsp70基因被沉默后,CSBV感染幼虫体内CSBV拷贝数降低,说明Hsp70参与了CSBV复制过程。