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由Bt(Bacillus thuringiensis)产生的Cry蛋白引起昆虫死亡的过程中,Cry蛋白与昆虫中肠受体蛋白的结合起着至关重要的作用,结合能力的下降或丧失将导致昆虫对Cry蛋白抗性的产生。已有报道表明Polycalin是昆虫中肠上Cry1Ac的结合蛋白,本文在棉铃虫Polycalin基因的克隆、m RNA表达谱分析及其功能方面进行了研究。通过PCR结合RACE技术克隆获得了棉铃虫Polycalin基因的全长序列;利用实时荧光定量PCR技术测定了在棉铃虫不同发育时期、幼虫肠道不同部位的Polycalin基因表达量;比较了棉铃虫取食含Cry1Ac蛋白的饲料后,Polycalin基因表达量的变化;利用原核表达的方法表达Polycalin的部分片段,合成抗体后,通过western blot和ligand blot的方法检测了Polycalin蛋白与Cry1Ac的结合特性;运用PCR扩增、荧光定量和i TRAQ的方法,比较了抗性和敏感棉铃虫Polycalin在基因序列、m RNA表达量、蛋白表达量方面的差异。主要结果如下:1.通过PCR结合RACE技术克隆获得了棉铃虫Polycalin基因的全长序列,该基因全长序列为2955bp,开放阅读框为2781bp,编码926个氨基酸(Gen Bank登录号为KP100652);预测蛋白的分子量为101.68KD,等电点为4.57。推导的氨基酸序列中,N末端含有20个氨基酸组成的信号肽,含有8个O-糖基化位点,3个N-糖基化位点,C末端存在2个GPI结合位点。2.Polycalin在棉铃虫所有发育阶段都可以表达,幼虫期表达量较高,尤其在1-3龄幼虫体内表达量最高,在卵、成虫和蛹中的表达量较低。棉铃虫四龄幼虫取食含活化Cry1Ac蛋白的人工饲料后,Polycalin基因的表达受到抑制。3.通过原核表达Polycalin的部分片段,合成抗体后,通过western blot和ligand blot的方法检测了Polycalin蛋白与Cry1Ac的结合特性。抗性及敏感棉铃虫品系Polycalin基因序列在编码区核苷酸水平上存在4个突变,但是在氨基酸水平上没有差异;抗性品系4龄棉铃虫幼虫Polycalin基因的表达量极显著高于敏感品系,敏感品系棉铃虫2龄幼虫及成虫中Polycalin基因的表达量都显著高于抗性品系。Western blot及i TRAQ实验结果表明,Polycalin蛋白在抗性品系中的表达量都比较高。以上结果说明棉铃虫Polycalin是Cry1Ac的结合蛋白,并且在抗性品系中Polycalin的蛋白的表达量升高。Polycalin基因是否在棉铃虫的抗性演化中是否发挥作用还需要进一步的验证。