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目的:模拟心肌微环境,促小鼠心脏成纤维细胞(Cardiac fibroblasts, CFs)源的诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell, iPS)向心肌细胞(cardiomyocyte, CM)分化,为在体原位利用梗死区CFs修复梗死心肌,补充具有完全功能的心肌细胞,提供实验依据。
方法:1、分离培养心肌细胞;2、采用EB球分化的方法,根据不同的定向分化诱导条件,将CFs来源的iPS细胞分为阴性对照、自发分化组、BMP2诱导组和心肌细胞Transwell共培养组,以自发分化的ES细胞和未诱导分化的iPS细胞为对照,检测CFs源iPS细胞的心肌分化能力。对心肌细胞进行以下鉴定:(1)跳动EB的观察计数;(2)Realtime-PCR检测心肌发育重要转录因子、肌结构基因(Nkx2.5、GATA4,TBX5,α-Actin、cTnI、α-MHC)及重要多能性因子(Oct4、Nanog、Isl1)的核酸水平表达;(3)免疫荧光染色检测心肌Marker的蛋白表达;(4)通过膜片钳等电生理技术检测心肌动作电位,验证所得细胞的自律性。
结果:1、在体外采用Transwell共培养体系模拟了“心肌”微环境的旁分泌作用。2、心肌细胞的定向分化和鉴定:(1)CFs源的iPS细胞可形成自发搏动的拟胚体球;在分化14天时,采用心肌共培养诱导条件和BMP2刺激条件的iPS细胞分化出的跳动EB明显较自发分化的iPS细胞和ES细胞为多(P<0.01)。(2)与BMP2诱导和单纯的EB自发分化相比,采用心肌细胞共培养方法,所得细胞心肌发育重要转录因子、肌结构基因(Nkx2.5,GATA4,TBX5,α-Actin,cTnI,α-MHC)mRNA均表达较高(P<0.01),而全能性因子Oct4和Nanog表达较低(P<0.01)。(3)CFs源的iPS诱导定向分化的EB可见cTnl和CX43免疫荧光阳性的细胞表达,消化为单细胞后荧光免疫双标染色可见Nkx2.5和cTnI均为阳性。(4)CFs源的iPS细胞经诱导分化后具备自律性,跳动速率在40~130bpm(beats per-minute)之间,动作电位特点与心房肌细胞相似;同时对心率调节药物具有敏感性。
结论:1、小鼠CFs源的iPS细胞,经定向诱导能够分化为功能性心肌细胞,可以作为新的心肌细胞再生来源。2、本实验利用Transwell共培养体系模拟心肌微环境,可有效的定向诱导CFs源的iPS细胞向心肌细胞分化,且效果优于BMP2的诱导和自发分化。