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【背景】最早在研究果蝇发育过程中发现,TWIST参与调节多种发育过程,尤其在早期中胚层的形成方面起重要作用。1996年人类TWIST基因被成功克隆,定位于7p21.2,编码203个氨基酸,分子量约28Kd。TWIST蛋白是具有碱螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix, bHLH)结构的转录因子家族成员,其可以与另外一个同源或异源的bHLH因子结合,形成二联DNA结合域,特异性地结合E-box consensus sequence (CANNTG)从而激活或抑制特异性的靶基因转录。近年来的研究表明TWIST是个新的癌基因,TWIST可以通过p53依赖与非依赖的途径参与细胞的凋亡抵抗。目前研究表明,TWIST过表达在肿瘤的发生、侵袭转移、血管生成与肿瘤细胞耐药中发挥重要作用,但是其中的具体机制尚不清楚。有关TWIST在胃癌发生、发展中的作用尚无深入的研究,参与调控TWIST的分子及其机制未见报道。本研究拟构建TWIST不同表达水平的胃癌细胞亚系,观察TWIST对胃癌细胞生物学行为的影响,探讨TWIST在胃癌发生、进展与血管生成中的作用,以及参与调控TWIST的分子及其机制。【目的】1.研究TWIST在胃腺癌中的表达及其临床意义;2.观察TWIST对胃癌细胞生物学行为及肿瘤血管生成的影响,并探讨可能的机制;3.研究缺氧与TWIST的关系及其调控的分子机制。【方法】1.采用免疫组织化学方法观察TWIST在胃癌组织中表达与细胞内的定位,并分析TWIST蛋白表达与临床病理资料之间的关系。2.采用半定量RT-PCR与Western blot方法检测TWIST在不同胃癌细胞系和永生化的胃上皮细胞中的mRNA和蛋白表达水平,以及新鲜胃癌及癌旁组织中TWIST的蛋白表达情况。3.将含有TWIST全长cDNA的正义真核表达质粒pcDNA3.0-TW与构建的TWIST特异性的小干扰RNA质粒pSilencer-TW1与pSilencer-TW2分别转染胃癌细胞系SGC7901,经G418筛选,建立TWIST不同表达水平的胃癌细胞亚系。4.采用MTT实验,流式细胞仪技术、细胞损伤刮擦实验、细胞侵袭实验、裸鼠移植瘤实验研究不同TWIST表达水平对胃癌细胞SGC7901的生长、细胞周期、细胞凋亡、移动、侵袭以及体内形成肿瘤能力的影响,并且Western blot方法检测凋亡相关分子的变化。5.应用ELISA法检测不同胃癌细胞亚系培养上清中VEGF蛋白含量。6.免疫组织化学方法检测裸鼠移植瘤组织中Ⅷ因子相关抗原的表达,比较分析不同移植瘤组织中微血管密度(MVD)。7.建立体外缺氧模型,检测缺氧条件下胃癌细胞系SGC7901中缺氧诱导因子-1(HIF-1)的表达变化,以及TWIST在基因转录和蛋白翻译水平的变化,利用HIF-1αsiRNA转染的细胞系SGC7901,研究缺氧条件下TWIST的表达变化,初步确立HIF-1α与TWIST之间的调控关系。8.构建TWIST的报告基因载体,利用双荧光素酶报告基因实验检测在缺氧条件下或共转染HIF-1α真核表达质粒时,TWIST启动子活性的变化。9.利用染色质免疫共沉淀(ChIP)实验初步筛选鉴定TWIST启动子上的HIF-1α结合位点。10.利用凝胶电泳迁移率变动实验(EMSA)与超变动分析(Super shift assay)确定TWIST启动子中与HIF-1α结合的功能位点。【结果】1.免疫组化的结果显示:与正常胃黏膜相比,胃癌组织中TWIST染色强度明显增强;TWIST在不同分化程度的胃癌组织、黏液癌及印戒细胞癌、淋巴结转移癌中均有阳性表达,TWIST蛋白在胃癌组织中主要定位于细胞胞浆,也可见部分细胞核着色;76例胃癌中TWIST的阳性率为46.1% (35/76,与正常胃黏膜比较p<0.05),中、低分化腺癌阳性率高于高分化腺癌(p<0.05),在有淋巴结转移的胃癌组织中TWIST阳性率高于无淋巴结转移的胃癌组织(p<0.05)。2.Western blot检测显示:与对应的癌旁组织相比,胃癌组织中TWIST的表达显著升高。3.半定量RT-PCR与Western blot的结果显示:与永生化的胃黏膜上皮细胞GES-1相比,TWIST mRNA与蛋白质在多种胃癌细胞系中高表达。4.成功构建了TWIST特异性的小干扰RNA质粒pSilencer-TW1与pSilencer-TW2,分别转染TWIST正义质粒pcDNA3.0-TW与pSilencer-TW1、pSilencer-TW2到SGC7901细胞,经Western blot鉴定,获得TWIST表达上调、下调SGC7901细胞亚系: SGC7901/pcDNA3-TW和SGC7901/pSi-TW1。5.MTT结果显示: SGC7901/pcDNA3-TW细胞增殖速率较对照细胞加快;SGC7901/pSi-TW1细胞增殖速率较对照细胞减慢。6.流式细胞仪技术检测细胞周期分布的结果提示: SGC7901/pcDNA3-TW细胞增殖指数较对照增加(45.4 vs 40);SGC7901/pSi-TW1细胞增殖指数降低(32.8 vs 39.7)。7.流式细胞仪检测细胞凋亡结果表明: SGC7901/pcDNA3-TW细胞中凋亡细胞所占百分比低于亲本细胞和空载体转染的细胞;SGC7901/pSi-TW1细胞中凋亡细胞所占比例高于亲本细胞和空载体转染的细胞。8.Western blot结果显示: SGC7901/pcDNA3-TW细胞中bcl-2表达升高,bax表达下降,bcl-2/bax比值升高;SGC7901/pSi-TW1细胞中bcl-2表达下降,bax表达升高,bcl-2/bax比值降低。9.损伤刮擦实验的结果显示:相同时间内SGC7901/pcDNA3-TW组细胞进入划痕区域的细胞数目较空载体SGC7901/pcDNA3组多,而SGC7901/pSi-TW1组细胞进入划痕区域的细胞数目较空载体SGC7901/pSi组少。10.Transwell小室实验结果显示: SGC7901/pcDNA3-TW组穿过膜细胞数较对照组增多,而SGC7901/pSi-TW1组穿过膜细胞数目较对照减少,相对侵袭指数差异有显著性(p<0.05)。11.转染细胞裸鼠体内成瘤实验结果:接种31天处死裸鼠取出瘤体,测量裸鼠移植瘤体积(±SD,mm3)示:SGC7901/pcDNA3-TW组为1558.40±270.36,与对照组比较肿瘤体积大(p<0.05),SGC7901/pSi-TW1组为389.46±80.63,与对照组比较肿瘤体积小(p<0.05);瘤体重量(±SD,mg)示:SGC7901/pcDNA3-TW组为1364.40±271.30,SGC7901/ pSi-TW1组为370.25±80.61,组间统计学分析与肿瘤体积结果一致。12. ELISA法检测细胞培养上清中VEGF蛋白含量表明:SGC7901/pcDNA3-TW细胞分泌VEGF的水平明显高于SGC7901与SGC7901/pcDNA3细胞(p<0.05),而SGC7901/pSi-TW1细胞分泌VEGF的水平低于SGC7901与SGC7901/pSi细胞(p<0.05)。13.Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学染色显示:胃癌裸鼠移植瘤组织内微血管内皮细胞染色阳性,其中SGC7901/pcDNA3-TW肿瘤组的MVD(31.20±4.30)高于SGC7901组和SGC7901/pcDNA3组(p<0.05),而SGC7901/pSi-TW1组(7.50±1.83)低于SGC7901组和SGC7901/pSi组(p<0.05),对照组间比较差异无显著性。14. RT-PCR与Western-blot结果显示:随着缺氧时间的延长HIF-1α的mRNA表达水平无明显变化而蛋白表达水平升高;缺氧诱导胃癌细胞系SGC7901中TWIST mRNA及蛋白表达上调,并且具有时间依赖性;应用siRNA技术抑制HIF-1α表达后再进行缺氧诱导,与对照细胞系相比TWIST mRNA与蛋白的表达均无明显上调,提示缺氧通过HIF-1α调控TWIST的表达。15.生物信息学分析发现:在TWIST转录启始点附近-1442～+152范围内存在6个HRE的可能结合位点,利用PCR技术克隆了包含6个HRE的长1601bp的启动子片段,通过基因重组技术与PGL3-enhancer载体连接,经酶切、测序证实成功地构建了报告基因载体pGL3-TW。16.双荧光素酶报告基因实验结果显示:缺氧或者转染pcDNA3.1/HIF-1使TWIST的启动子活性升高3.0～4.5倍,说明缺氧通过HIF-1α对TWIST启动子有转录激活作用。17.染色质免疫共沉淀实验结果显示:在TWIST启动子-1014～-799bp区域(包含-1003～-997、-887～-880、-817～-811,3个疑似HRE)扩增出阳性条带,条带大小与预期一致,提示在TWIST启动子-1014～-799bp区域中存在HIF-1的结合位点。18.EMSA和Super shift试验结果显示:在转录起始位点的-1014～-799bp区域内的第一个潜在的HRE结合位点(-1009～-991)与缺氧条件下提取的核蛋白提取物有很强的结合能力,启动子探针电泳滞后,抗HIF-1α抗体可以导致电泳条带的进一步滞后,加入冷探针竞争后HIF-1α/DNA复合物的条带明显减弱,加入突变探针竞争后HIF-1α/DNA复合物的条带无变化,而其余两个潜在的结合位点迁移率变动没有影响。提示:在TWIST启动子距转录起始位点的-1003～-997处存在与HIF-1α结合的功能位点,HIF-1α通过结合该位点发挥作用。【结论】我们的研究结果表明:1.TWIST在胃癌组织、细胞系中表达显著上调,提示其在胃癌的发生及发展中起重要的作用,并且参与了肿瘤的转移,TWIST可能成为判断胃癌预后的指标与治疗的靶点。2. TWIST可通过细胞周期、凋亡、侵袭及血管生成等机制在胃癌的发生发展中发挥作用。3.缺氧可以诱导TWIST的表达,并且是通过HIF-1α与TWIST的启动子直接结合,从而激活TWIST mRNA转录、蛋白翻译。