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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS),俗称“猪蓝耳病”,属于一种高度接触性传染病,猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)是形成该病的病原,该病临床表现为母猪妊娠期流产、返情、死胎及各年龄段猪不同程度的呼吸道症状。猪体感染PRRSV后猪体免疫抑制,先天免疫应答障碍,后天获得性免疫缓慢,造成细菌或其他病毒的混合感染或继发感染。严重阻碍了世界养猪业的进步,制约全球养猪业的发展步伐。RNase L(Ribonuclease L)是由干扰素(IFN)刺激产生的抗病毒蛋白(Antiviral protein, AVP),参与宿主的特异性免疫和非特异性免疫,在机体的抗病毒和免疫调节等过程中起着举足轻重的作用。激活后的RNase L具有抑制RNA病毒和部分DNA病毒复制增殖的作用,我们通过研究发现,猪的RNase L (sRNase L)对PRRSV在宿主内的增殖也具有一定的抑制能力,激活后的sRNase L明显降低了PRRSV的滴度。围绕sRNase L抗PRRSV活性及其初步机制的探索,本论文开展了以下几个方面的研究：1. sRNase L真核表达载体的构建及其表达根据GenBank中Sus scrofa RNase L基因序列全长设计一对特异性引物,上游添加真核表达增强序列Kozak序列,下游添加HA标签序列；利用Poly (I:C)刺激,从PK-15细胞(猪肾上皮细胞)中扩增sRNase L基因全长。全长目的基因sRNase L和真核表达载体pXJ41经双酶切后连接构建pXJ41-sRNase L真核表达载体；重组表达载体经双酶切验证、测序分析正确后,Western blotting检测目的蛋白的表达。结果表明,成功构建了表达sRNase L蛋白的真核表达载体。2. PRRSV病毒量及IFN-β mRNA表达水平real-time PCR检测方法的建立本研究利用PRRSV的N蛋白基因、IFN-β、管家基因GAPDH的基因序列分别设计特异性引物,并构建含有PRRSV N蛋白基因的重组质粒为阳性标准品,建立标准曲线,定量检测PRRSV N蛋白基因的拷贝数用以衡量PRRSV的病毒量；以2-ΔΔCt为基础建立了IFN-p的相对定量检测方法。两种方法具有线性关系良好、敏感性高的优点,对两种基因的检测特异性强,扩增片段呈现特异、单一的熔解峰；目的基因和内参基因片段的扩增效率也比较高,因此,可以用来分析PRRSV病毒量及IFN-p mRNA的水平。3. sRNase L抗PRRSV活性及其机制初步研究RNase L在机体的抗病毒免疫过程中发挥着重要的作用,但sRNase L是否同样具有抗PRRSV的活性尚未确定,本研究探索了2-5A+/-条件下sRNase L不同转染量对PRRSV增殖的影响。我们发现,sRNase L对PRRSV的增殖具有一定的抑制能力,经过2-5A激活的sRNase L能够显著降低PRRSV的滴度。间接免疫荧光也证实了PRRSV N蛋白的表达明显降低,从而确定了sRNase L具有抗PRRSV的活性。进一步通过TFN-β mRNA水平、ISRE启动子活性等的检测初步探索了其抗病毒机制,MARC-145细胞转染pXJ41-sRNase L后,相对荧光定量PCR显示IFN-p mRNA水平得到了明显的提高,Luciferase试验表明ISRE启动子活性显著提高,初步探索了sRNase L通过增强Ⅰ型IFN表达的同时也增强ISRE的表达来强化其抗病毒能力的分子机制,为更进一步阐明sRNase L抗PRRSV的机制以及新型抗病毒制剂的研究开发奠定了重要的基础。