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研究背景:急性肺损伤(Acute lung injury,ALI)发展到一定程度会恶化成急性呼吸窘迫综合征(Acute respiratory distress syndrome,ARDS),它们是临床常见的急重症。近年来,尽管呼吸支持等治疗手段已广泛运用于临床,但ALI/ARDS的病死率仍然高达40%[1,2]。失控的炎症反应是导致ALI/ARDS的主要原因。因此,深入研究炎症反应的机制将为临床上治疗ALI/ARDS提供重要的理论基础。在ALI/ARDS过程中,Ⅱ型肺泡上皮细胞是炎症因子的重要来源。因此,在Ⅱ型肺泡上皮细胞中研究炎症因子产生的机制将为从该细胞入手发现治疗ALI/ARDS的策略提供重要的理论基础。炎症因子的表达主要受转录因子调控。因此,在本课题中,我们从转录因子入手研究了肿瘤坏死因子-α(TNF-α)刺激Ⅱ型肺泡上皮细胞表达IL-6的机制。研究目的:1)在经TNF-α刺激的Ⅱ型肺泡上皮细胞中,确定核因子活化B细胞κ轻链增强子(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells,NF-κB)、CCAAT增强子结合蛋白(CCAAT/enhancer binding protein,C/EBP)及激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)转录活性变化。2)确定上述转录因子对TNF-α诱导IL-6表达的影响,从而在转录水平上阐明TNF-α诱导IL-6在Ⅱ型肺泡上皮细胞中表达的机制,为临床上抑制IL-6表达从而治疗ALI/ARDS打下坚实的理论基础。研究方法:在TNF-α处理的Ⅱ型肺泡上皮细胞中,用qPCR在mRNA水平检测IL-6的表达。构建野生型IL-6启动子驱动的荧光素酶(Luciferase)表达载体(IL-6 Luc)以及各种删减的IL-6启动子突变体驱动的Luciferase表达载体。在TNF-α的刺激下,检测Ⅱ型肺泡上皮细胞中IL-6启动子以及它的各种突变体驱动的Luciferase的表达,从而发现可能涉及IL-6转录表达的转录因子。转录因子AP-1:用蛋白印迹分析分别检测JNK和c-Jun的磷酸化水平。构建AP-1结合位点突变的IL-6 Luc,然后检测该突变对IL-6 Luc的影响。构建c-Jun过表达载体,然后检测其对IL-6 Luc的影响。用PCR的方法构建第63位和第73位丝氨酸突变的c-Jun,然后检测其对IL-6 Luc的影响。用shRNA下调内源性c-Jun的表达,然后用qPCR和ELISA的方法分别在mRNA水平和蛋白水平检测内源性IL-6的表达。转录因子C/EBP:TNF-α刺激的Ⅱ型肺泡上皮细胞中用Western Blot检测C/EBPδ的表达。构建C/EBP结合位点突变的IL-6 Luc,然后检测该突变对IL-6 Luc的影响。用shRNA下调内源性C/EBPδ的表达,然后用qPCR和ELISA的方法分别在mRNA水平和蛋白水平检测内源性IL-6的表达。用同样的方法检测在Ⅱ型肺泡上皮细胞中转录因子C/EBPβ是否对IL-6表达也有影响。转录因子NF-κB:用Western Blot检测IKKα/β和p65的磷酸化水平。构建NF-κB p65结合位点突变的IL-6 Luc,然后检测该突变对IL-6 Luc的影响。用PCR的方法构建丝氨酸534位突变的NF-κB p65,检测其对IL-6 Luc的影响。用shRNA下调内源性NF-κB p65的表达,然后用qPCR和ELISA的方法分别在mRNA水平和蛋白水平检测内源性IL-6的表达。最后,在原代细胞中用荧光素酶基因报告实验验证上述实验结果。结果:TNF-α刺激显著增加Ⅱ型肺泡上皮细胞转录表达IL-6。在TNF-α处理后,Ⅱ型肺泡上皮细胞中AP-1的转录活性明显增加;JNK和c-Jun磷酸化水平均升高;过表达c-Jun促进IL-6转录表达;IL-6启动子中AP-1结合位点突变、c-Jun磷酸化位点突变、降低c-Jun表达都会导致IL-6转录表达显著下降。在TNF-α处理后,Ⅱ型肺泡上皮细胞中C/EBP的转录活性明显增加;C/EBPδ的表达增加。过表达C/EBPδ促进IL-6转录表达;IL-6启动子中C/EBP结合位点突变、降低C/EBPδ表达都会导致IL-6转录表达显著下降。另外,C/EBP家族中另一种反式激活因子C/EBPβ的数据表明其不影响IL-6的表达。在TNF-α处理后,Ⅱ型肺泡上皮细胞中NF-κB的转录活性明显增加;IKKα/β和NF-κB p65磷酸化水平在一定时间内均升高而后降解;过表达NF-κB p65促进IL-6转录表达;IL-6启动子中的κB结合位点突变、NF-κB p65磷酸化位点突变、降低NF-κB p65表达都会导致IL-6转录表达显著下降。在原代Ⅱ型肺泡上皮细胞中,c-Jun,C/EBPδ和NF-κB p65过表达均会增加TNF-α诱导的IL-6的转录表达。结论:在Ⅱ型肺泡上皮细胞中,TNF-α通过正调控下列信号途径(JNK-c-Jun-AP-1结合位点,C/EBPδ-C/EBP结合位点以及IKK-NF-κB p65-κB结合位点)而增加IL-6的转录表达。本研究为在转录水平特异性降低IL-6表达,从而治疗由Ⅱ型肺泡上皮细胞过度分泌IL-6引起ALI/ARDS提供了重要的理论基础。