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炭疽芽胞杆菌（Bacillus anthracis）是人畜共患传染病——炭疽（anthrax）的病原体。炭疽危害巨大,作为五大人畜共患传染病之一,可以通过食草类哺乳动物传染人类。感染途径主要有三种,即皮肤、肠、肺途径,分别造成皮肤炭疽、肠炭疽、肺炭疽,其中,皮肤炭疽约占炭疽总感染率的95%以上,主要表现为皮肤炭疽痈,肠炭疽和肺炭疽约占5%,肠炭疽主要表现为消化系统黏膜水肿和淋巴结肿大,肺炭疽主要表现为肺门淋巴结和纵隔障肿大,常并发炭疽脑膜炎,若不及时治疗,皮肤炭疽和肠炭疽可发展为败血症引起死亡,肺炭疽的死亡率也很高。此外,炭疽还可见其他感染型,如甲沟、眼结膜感染等。我国传染病防治法规定炭疽为乙类法定管理传染病,国家十分重视炭疽的防治工作,多年来一直将炭疽列为重点防治的传染病之一。此外,炭疽杆菌在有氧的大气环境中可形成芽胞,芽胞具有极强的抗逆性,常用的消毒手段如高温、化学试剂、电离辐射、紫外线等都难以将其灭活,并且其传染性可保持20到30年,便于储存和运输,因此炭疽芽胞杆菌长期以来被某些国家作为致死性生物战剂加以研究和使用,给国际社会的稳定和国家安全带来了日益严重的威胁。atxA基因参与了诸多毒素基因的调控,是炭疽芽胞杆菌调控网络的核心,但是,在Atx A调控的级联反应中有一个或多个毒力基因调控子仍旧没有鉴定,且atxA的调控方式还需要进一步探索,因此本研究围绕atx A基因展开,旨在利用组学的手段进一步揭开atxA基因功能,完善炭疽杆菌毒性调控网络,从而为更好的防治炭疽奠定理论基础。本研究的研究思路是构建炭疽芽胞杆菌B17D2菌株的atxA基因缺失突变株B17D2△atxA::spc和回复株B17D2△atxAR,从蛋白质组学和转录组学两个方面分析atxA基因调控的蛋白。由于炭疽芽胞杆菌基因敲除效率偏低,在本研究中首先改进了炭疽芽胞杆菌的基因敲除方法,提高了炭疽芽胞杆菌的基因敲除效率。该体系采用Golden Gate克隆和I-Sce I反筛位点相结合的方法,利用IIs型限制性内切酶酶切位点和识别位点不在同一区域的原理,合理的设计了IIs型限制性内切酶酶切位点,使酶切和连接在同一体系中同时进行,成功构建了atxA基因敲除载体,并在载体中插入了I-SceI酶切位点,提高了同源臂的重组效率,成功构建了炭疽芽胞杆菌B17D2菌株的atxA基因缺失突变株B17D2△atxA::spc,并通过测序和RT-PCR以及Western Blot多种方法验证了菌株的正确性。回复株的构建是在B17D2△atxA::spc菌株中导入atxA基因表达载体pBE2A-atx A质粒,并用RT-PCR的方法验证了atxA基因已得到表达。在此基础上,通过对B17D2和B17D2△atxA::spc两株菌进行细胞总蛋白及分泌蛋白双向电泳及MALDI-TOF/TOF质谱分析和表达谱基因芯片分析,在蛋白质组学和转录组学两个方面分析了atxA基因所调控的基因,得到如下结果:在蛋白质组学研究中,共发现B17D2菌株与B17D2△atxA::spc菌株的差异蛋白50种,其中在B17D2△atxA::spc菌株中上调表达的基因有30个,下调表达的基因有20个,发现已知受atxA正调控的S-层蛋白基因eag基因,并发现其他未报道过的基因主要集中在磷酸戊糖途径代谢,丙酸代谢和丙酮酸代谢通路;质谱鉴定的结果显示,未报道受到atxA基因正调控的基因有tkt-2、BA3760、yqiQ、BA4202、BA2500;受到atxA基因负调控的基因pfl、BA0541、rpsB、sodA-1。在转录组学研究中,发现在无CO2条件下培养的B17D2菌株与B17D2△atxA::spc菌株的表达差异基因2487个,其中上调表达的基因有1111个,下调表达的基因有1376个;在5%CO2条件下培养的B17D2菌株与B17D2△atxA::spc菌株的表达差异基因1049个,其中上调表达的基因有445个,下调表达的基因有604个;在5%CO2条件下培养的原始菌株B17D2相对于无CO2条件下培养有差异基因2042个,其中上调表达的基因有1065个,下调表达的基因有977个;在5%CO2条件下培养的B17D2△atxA::spc菌株相对于无CO2条件下培养有差异基因1833个,其中上调表达的基因有1037个,下调表达的基因有796个;发现已报道的atxA基因调控毒力基因pagA、pagR、cya、sap等基因;在无CO2条件下发现了atxA调控了一些未报道的芽胞形成相关蛋白和脱氢酶,如BA1290、acoL、BA5570基因;在5%CO2条件下同样发现其调控的未报道过的多个芽胞形成相关蛋白sasP-1、BA0524、BA1324、BA3127、BA0519等。综合分析B17D2菌株与B17D2△atxA::spc菌株双向电泳结果的差异蛋白和基因芯片杂交实验结果中转录水平的差异基因可以得到如下结论:atxA基因调控多个毒力因子及相关基因的表达,对pagA、pagR、cya、sap基因的调控已在双向电泳和基因芯片杂交结果中得到了验证,与文献报道相符,此外,atxA基因还对一些芽胞形成蛋白和代谢相关蛋白具有调控作用,这些基因与atxA基因的调控关系尚未见文献报道,如BA1290、sipW、acoL基因等;CO2可能对atxA基因的调控有一定的影响,但还需要后续实验的验证;不论是原始株自身还是atxA基因缺失株自身,在5%CO2条件培养下都与无CO2条件培养下蛋白表达有明显差异,而且上调表达的基因较多。hutU、pfl、BA0010基因在B17D2△atxA::spc菌株中在转录水平和蛋白表达水平上调,说明atxA负调控了hutU、pfl、BA0010,并分别影响了组氨酸代谢、丙酮酸-甲酸盐裂解酶的合成和维生素B6生物合成酶的合成;hpt-1基因和sodA-1基因在B17D2△atxA::spc菌株中蛋白表达水平均上调,但转录水平下调,两基因分别编码次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖基酶和超氧化物歧化酶,调控关系还有待进一步分析。