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研究背景与目的:哺乳动物的心肌细胞出生后不久便会退出正常增殖的细胞周期,开启成体细胞的分化成熟。当心室壁存在机械压力时,心肌细胞因失去了增殖能力数量不能再增加,心肌细胞选择借助单个心肌细胞的大小增加降低心室壁负荷的同时使得心脏功能正常实现。成体心脏在生理和病理刺激条件下,会发生适应性肥大,但病理性肥大通常会发展为心力衰竭。各种不同的细胞内外传导途径参与调节不同形式的肥大。近十年来,愈来愈多的研究表明,以前未识别的机制(包括有细胞增殖、细胞生理代谢、免疫反应应答、非编码RNA、翻译修饰及表观遗传调节)正向或反向调节心脏肥大。CCR4-NOT(Carbon Catabolite Repression 4-Negative On TATA-less)复合物是一种在多物种中保守存在的多亚基去腺苷酸化复合物。已有研究发现CNOT3(Carbon Catabolite Repression 4-Negative On TATA-less subunit 3,CCR4-NOT 复合物的支架亚基3)是果蝇和小鼠心脏功能的保守调节剂。此外,全基因组关联研究GWAS(Genome-Wide Association Study)显示 CNOT1(Carbon Catabolite Repression 4-Negative On TATA-less subunit 1,CCR4-NOT 复合物的支架亚基 1)或 CNOT3 中的单核苷酸多态性与人类QT间期延长之间有很强的关联性。目前关于该复合物亚基CNOT3参与心肌肥大机制的研究还是基于其去腺苷酸化特性,例如监督并且控制自噬调节蛋白ATG的mRNA,最终与P53作用,加速导致心肌细胞死亡和心力衰竭。然而,CCR4-NOT复合物CNOT3免疫共沉淀高通量测序RIP-seq(RNA-Immunoprecipitation high-throughput sequencing)结果显示 CNOT3 与接近1000种mRNA有结合,如何细致地控制心脏功能的潜在机制仍然不清楚,而且基于生物分子的多重利用性及如此广泛的mRNA质量监控,有必要深入研究CNOT3是否通过影响某些信号通路中的关键分子等参与肥大机制。因此本研究旨在探讨研究CNOT3在病理性肥大特异性表达情况及其可能的调控作用机制,期望可以为心肌肥大的机制进展提供新的研究方向。早期实验发现Iwsl(IWS1,SUPT6 interacting protein)参与以Oct4为核心的小鼠胚胎干细胞多能性调控网络。Iwsl是哺乳动物维持细胞活力所必需的且在小鼠中各组织中的蛋白表达水平已显示出明显的差异,这种差异可能在胚胎发育早期就已涉及。这些前期研究表明Iws1在胚胎干细胞中可能有着至关重要的作用,但Iws1在胚胎早期发育中的作用还未有报道,值得更深入地探究其作用和机制。研究方法:利用反转录聚合酶链式反应(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western Blot,WB)检测临床标本对照组和肥厚性心肌病(Hypertrophic Cardiomyopathy,HCM)中CNOT3的表达情况以及小鼠主动脉缩窄(Transverse Aortic Constriction,TAC)术后的相应表达量。免疫组织化学染色侧面佐证小鼠TAC术后心脏切片结果并统计。构建CNOT3特异的短片段发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)和过表达质粒,转染新生乳大鼠心肌细胞,检测心房利钠肽Anp、B型利钠肽Bnp、α-肌球蛋白轻链Myh6、β-肌球蛋白重链Myh7的相对mRNA和蛋白水平变化。体外细胞水平利用苯肾上腺素PE(Phenylephrine,100μM)刺激模拟心肌肥大表型,利用RNAi敲低Cnot3考察对心肌肥大标志基因表达水平的影响。利用免疫荧光染色α-辅肌动蛋白(α-ACTININ),作为乳大鼠心肌细胞的表面积计算统计参考。下载GSE103629的RNA免疫共沉淀高通量测序CNOT3-RIP-seq数据分析可能的机制关联蛋白及信号通路。利用CRISPR-Cas9基因编辑技术建立稳定敲除Iws1的小鼠胚胎干细胞细胞系后,利用悬滴法诱导培养拟胚体(Embryoid Body,EB),在体外探究了该基因是否会影响中胚层的发育。同时也分离了分别出生1天、7天、21天、56天的小鼠心肌细胞进行该基因的定量检测。并使用GeneMANIA数据库确定了该基因的潜在靶标。此外,使用 WebGestalt 进行信号通路(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)与基因功能(Gene Ontology,GO)富集分析。研究结果:定量检测RT-PCR和蛋白质印迹法(Western Blot)检测临床标本对照组和肥厚性心肌病中CNOT3的表达情况为病理组中CNOT3表达高于对照组,并且免疫组织化学统计结果进一步验证了该结果的可靠性。正常培养的乳大鼠心肌细胞经慢病毒转染过表达CNOT3质粒后在mRNA水平可使得心肌肥大标志基因心房利钠肽Anp、B型利钠肽Bnp表达升高。与磷酸盐缓冲生理盐溶液(Phosphate Buffered Saline,PBS)处理的细胞相比,苯肾上腺素(PE)刺激条件下敲低CNOT3可以逆转肥大表型,同时利用免疫荧光进行骨架蛋白α-ACTININ染色计算细胞表面积进一步验证了敲低CNOT3可以抑制细胞肥大。RIP测序数据在www.geneontology.org网站做Biological Process分析,发现有46个蛋白与心脏形态发生有关。在小鼠胚胎干细胞诱导分化体系中,Iws1敲除抑制EB中胚层的发育。该基因在出生后21天的小鼠心肌细胞表现出高表达。Iws1具有19种潜在靶向基因。GO和KEGG分析表明,这些潜在靶基因与氧化还原反应,C型瘦蛋白受体信号通路和其他生理过程有关。研究结论:Cnot3在跨物种的多种病理性肥大表型中表达上调。在体外试验中,敲低Cnot3可以逆转肥大过程。RNA免疫沉淀试验表明CNOT3可以直接与一系列心脏发育基因的mRNA相结合,可能通过调节其稳定性发挥作用。因此Cnot3可能是心肌肥大的一个重要调控基因。Iws1参与小鼠胚胎干细胞中胚层分化,可能潜在调控中胚层源性终末分化器官的发育。