背景和目的动脉粥样硬化导致的心血管疾病严重影响人类的身心健康和生活质量。虽然近年来血管介入技术极大提高了缺血组织血流灌注并改善患者预后,但局部血管壁对损伤刺激的过度修复反应一直是困扰介入治疗的难题。老龄加重损伤血管过度修复,在当今人类社会逐步进入老龄化的时代,重视和加强老龄促动脉粥样硬化和损伤血管不良修复的研究具有重要意义。随年龄增长体细胞逐渐出现衰老和功能异常。长期以来关于老龄促进动脉粥样硬化和血管损伤后不良修复的研究主要集中在血管壁细胞衰老方面,但仍有一些现象并不能单纯用细胞衰老理论解释,如平滑肌细胞异常增殖是动脉粥样硬化和损伤血管不良修复的主要病理改变,通常认为衰老导致平滑肌细胞增殖能力更强,但也有资料表明老龄个体平滑肌增殖能力下降;另外关于细胞衰老指标检测,有研究表明由老龄个体分离的平滑肌细胞β-半乳糖苷酶染色阳性,也有研究发现其为阴性。这些矛盾现象提示老龄促进动脉粥样硬化发生和血管损伤后过度增殖可能并不完全由细胞衰老引起。通常认为老龄个体对炎症因子和生长因子的反应更强,是其促进平滑肌细胞增殖的机制。但事实上单纯针对这些炎症因子和生长因子的治疗措施并不能完全有效抑制损伤血管过度增殖。器官、组织由多种细胞共同构成,其发挥作用不完全是各种细胞独立作用的结果,细胞间调节也起了重要作用。目前已经发现内皮可通过细胞间调节影响平滑肌细胞生物学特性,然而相关研究多局限于一般成体情况下,尚不清楚老龄相关平滑肌细胞异常增殖是否也与内皮的异常调节有关。文献报道,年龄相关的组织修复能力异常可能与Notch信号途径有关。分布于血管系统的Notch信号分子包括:受体(Notch1,3,4)、配体(Delta-4,Jagged1,2)和效应器(HERP1,2,3),与血管形成、发育和重构密切相关。Notch信号是一种进化保守、存在于多种组织的控制细胞增殖、分化、粘附等细胞命运的信号转导系统,其对血管壁细胞增殖的调节主要是通过Jagged1/Notch1途径实现的。Liu等发现Notch1信号对增殖相关MAPK和PI3K/Akt信号系统的负调节有关,并且建立在更广细胞模型上的研究表明Notch信号对NFkappaB、Wnt/TCF等增殖相关信号也有对话调节作用。但目前关于Notch信号调节血管壁细胞增殖的研究主要是单纯针对内皮或平滑肌细胞的研究,对其在血管壁细胞间相互调节中的作用尚不清楚。与其它信号系统不同,Notch信号可以通过侧抑制机制调节邻近细胞增殖。因此,老龄相关平滑肌细胞异常增殖可能与内皮Notch信号对平滑肌增殖相关信号的对话调节有关。另外,凋亡也是机体调节细胞生长的一种重要方式,Notch1信号不仅参与细胞增殖的调控,还影响细胞凋亡。Robert等将红细胞与Jagged1过表达细胞共培养,发现Jagged1过表达细胞能诱导红细胞凋亡,提示Jagged1/Notch1可通过细胞间调节影响细胞凋亡。细胞的生长状态是增殖和凋亡系统平衡调节的结果,我们推测老龄个体平滑肌异常增殖可能是内皮Jagged1/Notch1信号激活障碍导致平滑肌细胞增殖-凋亡系统调节失衡所致。综上所述,我们拟从细胞和大体两个层面探讨内皮细胞Jagged1是否通过对平滑肌增殖凋亡相关信号的调节参与老龄相关平滑肌细胞异常增殖。希望从一个新的角度揭示老龄促动脉粥样硬化和血管损伤后不良修复的发病机制,为进一步探索改善或治疗老龄促动脉粥样硬化和损伤血管不良修复的方法提供研究基础。方法1.干扰和过表达载体构建部分构建含rat Jagged1 siRNA的腺病毒载体。使用Ambion公司软件设计后合成3个针对rat Jagged1基因的shRNA序列,用pGensil-1.1重组构建3个携带不同shRNA的表达质粒,SacI酶切鉴定及测序检测连接是否正确及有无突变。转染细胞后Realtime PCR检测筛选抑制效率最高的序列,将该序列其连接到穿梭质粒PGSadeno,通过LR体外同源重组包装重组腺病毒,XbaI单酶切鉴定重组克隆是否正确。转染293细胞扩增,空斑实验测定病毒滴度。构建含rat Jagged1基因的重组表达质粒。XbaⅠ酶切含有全长大鼠Jagged1基因的质粒pBOS–SN3T,胶回收后定向连接至线性化的真核表达载体质粒pCMV-IRES-GFP中,得重组质粒命名为p-rJagged1,转化、扩增细菌,NheⅠ酶切酶切鉴定,回收凝胶,再进一步转化、扩增细菌。2.在体实验部分复制大鼠颈动脉球囊损伤模型。2%戊巴比妥钠麻醉,暴露左颈总动脉及颈内、外动脉,自颈外动脉向近心端插入1.5F球囊导管至颈总动脉起始部,2个大气压使球囊膨胀30秒,后慢速回拉球囊至颈内外动脉分叉处,反复3次。退出导管,注入病毒液后夹闭动脉约10min。结扎颈外动脉,逐层缝合后常规饲养。术后7、14和21天取颈动脉,中间切片HE染色计算内膜与中面积比值。免疫荧光观察和western blot检测血管组织中GFP蛋白判断转染是否成功。Western blot检测PCNA蛋白表达。Realtime PCR检测Jagged1 mRNA表达。组织Tunel染色检测凋亡率。3.体外实验部分消化法培养大鼠主动脉内皮细胞(RAECs),抗vWF免疫荧光染色鉴定。组织贴块法培养大鼠主动脉平滑肌细胞(VSMCs),抗α-SM-actin免疫荧光染色鉴定。利用Transwell insert建立RAECs和VSMCs共培养体系。免疫荧光观察和流式检测GFP阳性细胞判断转染效率。细胞计数法、MTT法和3H-TdR掺入法检测VSMCs增殖能力。Hoechst33342染色和Annexin V-APC/7-AAD双标流式检测VSMCs凋亡率。Western blot检测Jagged1、NICD、Hey1、Bcl-2、α-SM-actin蛋白表达。Realtime PCR检测Jagged1、Notch1、Hey1 mRNA表达。结果1.大鼠Jagged1基因干扰腺病毒构建及鉴定设计合成了3条针对Jagged1基因的shRNA质粒,与pGenesil-1.1线性化载体连接,SacI酶切鉴定得约900bp的DNA条带,提示穿梭质粒构建成功,测序鉴定证明目的序列插入正确,且没有突变。将携带不同shRNA的穿梭质粒分别转染内皮细胞(ECs),Realtime PCR筛选出抑制效率最高的序列为GGAGAGTTACAGAATGGGA。重组构建携带用该序列的腺病毒,命名为Ad-si/rJagged1,XbaI单酶切鉴定得约3K的小条带,且大条带大于提示目的克隆是正确。将Ad-si/rJagged1转染293细胞,反复扩增后,收集粗制病毒裂解液,经空斑实验测定,病毒滴度约为6×10~9 pfu/ml。2.Jagged1在调节老龄相关血管损伤后新生内膜增生中的作用Western blot检测转染血管壁中有GFP蛋白表达,转染后第2d、7d均有较强表达,并延续表达到损伤后21d,对侧未转染血管中没有检测到GFP蛋白表达。分别用老龄大鼠和幼龄大鼠复制颈动脉球囊损模型。老龄组新生内膜-中膜面积比(I/M)较幼龄组显著增高。两组颈动脉Jagged1 mRNA水平在球囊损伤后均有一定程度增高,但老龄组Jagged1 mRNA峰值较幼龄组出现时间晚,且水平低。同时,老龄组PCNA蛋白和新生内膜细胞凋亡指数峰值较幼龄组出现时间晚,但PCNA蛋白峰值明显增高,凋亡指数峰值明显降低。分别用干扰腺病毒Ad-si/rJagged1或阴性对照腺病毒Ad-NSC转染球囊损伤的幼龄大鼠颈动脉。Ad-si/rJagged1转染组的Jagged1表达较未转染对照组峰值出现时间晚,水平降低,而Ad-NSC转染组与未转染对照组无统计学差异。同时,Ad-si/rJagged1转染的幼龄大鼠,颈动脉损伤后,PCNA蛋白峰值水平明显增高;新生内膜内细胞凋亡指数峰值则出现时间晚,且水平明显降低;而这两个指标在Ad-NSC转染组和control组间无统计学差异。最后,HE染色检测损伤21d后新生内膜情况, Ad-si/rJagged1转染组I/M较未转染组明显增加(2.45±0.18 vs. 1.46±0.08, P<0.01),而Ad-NSC转染组和未转染组新生内膜面积没有显著差别。3. ECs Jagged1在调节老龄相关平滑肌增殖凋亡中的作用及机制研究3.1老龄降低ECs Jagged1表达按大鼠年龄不同将ECs分幼龄组和老龄组。老龄组Jagged1 mRNA和蛋白水平均低于幼龄组。进一步检测Jagged1受体notch1及其下游靶基因Hey1表达,结果显示老龄组Notch1、Hey1 mRNA水平均低于幼龄组,同时活化的notch1受体胞内段NICD蛋白和靶基因Hey1蛋白也低于幼龄组。结果提示,老龄可以降低ECs Jagged1表达,至少部分抑制Jagged1/Notch1信号通路的激活。3.2老龄ECs促进VSMCs增殖、保护VSMCs凋亡将不同年龄大鼠来源的ECs与VSMCs共培养,分为老龄ECs共培养组和幼龄ECs共培养组。常规共培养情况下,两组VSMCs增殖能力无统计学差异;但在共培养体系中加入10μg/mL的血小板源生长因子(Platelet-derived growth factor, PDGF)后,老龄ECs共培养组VSMCs增殖能力均明显高于幼龄ECs共培养组(26772±936cpm/well vs. 16424±1008cpm/well , P<0.01)。常规共培养情况下,两组VSMCs凋亡率无统计学差异;但使用50μmol/L H2O2诱导24h后,老龄ECs共培养组VSMCs凋亡率明显低于幼龄ECs共培养组(8.42±1.02% vs. 17.61±2.16%, P<0.01)。结果表明,老龄ECs可以促进VSMCs的增殖,保护H2O2诱导的VSMCs凋亡。3.3 ECs Jagged1抑制VSMCs增殖、促进VSMCs凋亡Westernbolt检测发现,转染干扰腺病毒Ad-si/rJagged1,可使幼龄大鼠ECs Jagged1蛋白表达降低72%。转染过表达质粒p-rJagged1可使老龄大鼠ECs Jagged1蛋白表达增加约5倍。用转染Ad-si/rJagged1、Ad-NSC和未转染腺病毒的幼龄大鼠ECs分别与VSMCs共培养。转染Ad-si/rJagged1组VSMCs增殖能力较未转染组明显增强,而转染Ad-NSC组和未转染组增殖能力无统计学差异。同时,转染Ad-si/rJagged1组VSMCs凋亡率较未转染组明显降低,而转染Ad-NSC组和未转染组凋亡率无统计学差异。表明,下调ECs Jagged1表达可以促进VSMCs增殖,保护VSMCs凋亡。用转染p-rJagged1, vector及未转染质粒的老龄大鼠ECs分别与VSMCs共培养。转染p-rJagged1组VSMCs增殖能力较未转染组明显降低,而转染vector组和未转染组增殖能力无统计学差异。同时,转染p-rJagged1组VSMCs凋亡率较未转染组明显增高,而转染vector组和未转染组凋亡率无统计学差异。表明,上调ECs Jagged1表达可以抑制VSMCs增殖,促进VSMCs凋亡。3.4 ECs Jagged1对共培养VSMCs a-SM-actin蛋白表达的影响用不同年龄大鼠ECs和VSMCs共培养(加入PDGF, 10μg/mL)48h后,检测发现,老龄ECs共培养组a-SM-actin蛋白低于幼龄ECs共培养组。分别用转染p-rJagged1、转染vector和未转染的老龄ECs与VSMCs共培养(加入PDGF, 10μg/mL)48h后,p-rJagged1组a-SM-actin蛋白明显高于vector和未转染组(0.87±0.05 vs 0.57±0.03 vs. 0.56±0.04,P< 0.01)。然后,分别用转染了Ad-si/rJagged1、Ad-NSC和未转染的幼龄ECs与VSMCs共培养(加入PDGF, 10μg/mL)48h后,Ad-si/rJagged1组a-SM-actin蛋白明显低于Ad-NSC和未转染组(0.24±0.02 vs 0.61±0.03 vs. 0.62±0.03,P<0.01)。提示上调ECs Jagged1表达可以增加共培养SMCs的a-SM-actin表达,反之则降低其a-SM-actin蛋白水平。3.5 Bcl-2蛋白在ECs Jagged1调节VSMCs凋亡中作用不同年龄ECs和VSMCs共培养24h后,加入50μmol/L的H2O2诱导24h。检测VSMCs中抗凋亡蛋白Bcl-2水平,发现老龄ECs共培养组Bcl-2蛋白水平高于幼龄ECs共培养组。分别用转染p-rJagged1、转染vector和未转染的老龄ECs替代原体系中的ECs,再检测发现p-rJagged1组VSMCs的Bcl-2水平显著降低,提示ECs Jagged1可以降低VSMCs抗凋亡蛋白Bcl-2表达。转染表达质粒p-rBcl-2可明显增高VSMCs Bcl-2蛋白水平,且与过表达Jagged1的ECs共培养时,转染p-rBcl-2的VSMCs凋亡率较转染vector或未转染者明显降低,提示ECs Jagged1可能至少部分通过降低VSMCs的Bcl-2蛋白发挥促凋亡作用。结论1.血管损伤后Jagged1表达增高。但与幼龄大鼠相比,老龄大鼠Jagged1上调时间晚,达峰时间晚且峰值水平明显降低。同时,损伤血管PCNA蛋白上调时间早,峰值水平明显增高;而新生内膜细胞凋亡指数峰值出现时间晚,且水平明显低。2.下调血管Jagged1可以加重新生内膜增生。3.老龄降低培养ECs Jagged1表达,至少部分抑制Jagged1/Notch1信号通路的激活。4.与老龄ECs共培养,VSMCs增殖能力增强、VSMCs凋亡减少。5. ECs Jagged1具有抑制VSMCs增殖、促进VSMCs凋亡的作用。6. ECs Jagged1可增加共培养VSMCs a-SM-actin蛋白表达;可能至少部分通过降低VSMCs的Bcl-2蛋白发挥促凋亡作用。