一、研究目的良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia,BPH)是老年男性的常见病、多发病。随着老龄人口日趋增多,良性前列腺增生的发病率不断攀升,严重影响着老年男性的身心健康和生存质量。BPH的发病机理目前尚未完全明了,研究资料显示BPH是因为尿道周围前列腺基质和腺体增生所致。从细胞凋亡的角度来看,由于细胞过度增殖或者凋亡障碍(程序性细胞死亡),导致细胞净增加有关,因此细胞凋亡学说越来越受到重视,并认为凋亡减少和细胞增殖参与了BPH的发生,所以维持前列腺组织内环境的稳定及干预BPH的进展是药物治疗的一个重要目标。本论文分别在临床以及动物实验两方面,通过免疫组织化学的方法,探讨中成药益肾通胶囊对良性前列腺增生的作用机制与环节,以及其对人以及大鼠前列腺组织细胞增殖与细胞凋亡状态的影响,为中医中药治疗良性前列腺增生提供科学的依据。二、研究内容(一)临床研究1.资料与方法按随机、对照的原则,将符合纳入标准的受试对象按顺序编号,按1:1的比例,根据治疗用药的情况分为益肾通胶囊治疗组、非那雄胺对照组。治疗组给予口服益肾通胶囊共3个疗程;对照组给予口服非那雄胺共3个疗程。3个疗程后,具手术指征的患者接受手术治疗,术后取得患者的增生的前列腺病理组织。为对照需要,加入正常前列腺组。应用免疫组化方法检测益肾通胶囊治疗组、非那雄胺对照组以及正常前列腺组,通过观察其中的Ki-67/cD34、bcl-2/bax这些指标表达的强弱,来判断前列腺组织细胞凋亡的情况,探讨益肾通胶囊对人增生前列腺组织细胞凋亡的影响。2.结果(1)增生前列腺组织的bcl-2蛋白表达阳性率显著高于正常前列腺组织(P＜0.01),提示bcl-2蛋白的过表达而导致细胞凋亡的减少在BPH的发生过程中起着重要作用。bcl-2在BPH中表达较正常前列腺增强,而细胞凋亡正好相反,这与以前报道一致,因此提示在前列腺中bcl-2蛋白表达与细胞凋亡呈负相关。(2)正常前列腺组织上皮细胞和间质中均有bax蛋白表达,以上皮细胞表达明显。虽然增生前列腺组织的bax蛋白表达阳性率要比正常前列腺组织低,但无统计学意义(P＞0.05),提示bax在BPH的发生、发展过程中所起作用并不显著。(3)bcl-2蛋白在治疗组、对照组两组表达阳性率无显著差异(P＞0.05),bax蛋白在治疗组、对照组两组表达阳性率无显著性差异(P＞0.05)。提示益肾通胶囊治疗良性前列腺增生,机理是促进增生前列腺细胞凋亡,从而达到减小前列腺体积,缓解前列腺增生的压迫以及刺激症状等治疗效果,能够达到与非那雄胺相似的治疗效果。(4)益肾通胶囊和非那雄胺均可使Ki-67指数减少,CD34表达含量减少的作用,提示临床上可通过抑制前列腺组织新生血管产生而达到治疗BPH的目的,而益肾通胶囊和非那雄胺的作用机制均可能与此有关。(二)动物实验研究1.资料与方法将75只雄性SD实验大鼠随机分为正常对照组、增生组、益肾通胶囊高剂量组、益肾通胶囊低剂量组、非那雄胺对照组5组。成功建立前列腺增生大鼠模型后,除正常对照组,给予其他不同组大鼠分别以生理盐水、益肾通胶囊高剂量、益肾通胶囊低剂量以及非那雄胺灌胃。完成灌胃后,处死所有的大鼠并取得其前列腺组织,通过免疫组化的方法测定bcl-2/bax、Ki-67表达的强弱,评价益肾通胶囊高、低剂量对大鼠前列腺细胞凋亡的影响。2.结果(1)与增生组比较,益肾通胶囊高、低剂量组及非那雄胺组的前列腺湿重、体积及指数明显低于增生组(P＜0.05或P＜0.01);与非那雄胺对照组相比较,益肾通胶囊高、低剂量组的前列腺湿重、体积及指数虽然高于非那雄胺组,但差别无显著性(P＞0.05)。结果证明益肾通胶囊高、低剂量的效果与非那雄胺相似,能够降低实验性大鼠的前列腺湿重、体积、指数。(2)通过对各组大鼠前列腺组织的HE染色的观察,结果证明益肾通胶囊高、低剂量均能够改善大鼠前列腺组织病理增生改变。(3)与正常组比较,益肾通胶囊高、低剂量组、增生组bcl-2蛋白表达明显高于正常组,差别有显著性差异(P＜0.01);与增生组比较,益肾通胶囊高、低剂量组及非那雄胺组的bcl-2蛋白表达均低于增生组,比较有明显差异性(P＜0.05);与非那雄胺组相比较,益肾通胶囊高、低剂量组的bcl-2蛋白表达与非那雄胺组无显著性差异。而bax蛋白在正常组、增生组、益肾通高、益肾通低组、非那雄胺组各组阳性表达率无显著性差异,(均P＞0.05)。提示益肾通胶囊能够调节大鼠前列腺组织bcl-2及bax表达的平衡,促进前列腺细胞凋亡。(4)正常对照组前列腺组织中Ki-67无表达。与正常组比较,增生组、益肾通胶囊高低组、非那雄胺组的Ki-67表达显著高于正常组(P＜0.01),差异有显著性。与增生组比较,益肾通胶囊高、低组和非那雄胺组Ki-67表达显著下降(P＜0.05或P＜0.01);与非那雄胺组比较,益肾通胶囊高、低剂量组Ki-67表达均高于非那雄胺组,其中益肾通胶囊低剂量组Ki-67表达升高有统计学意义(P＜0.05),益肾通胶囊高剂量组Ki-67升高无统计学意义(P＞0.05);益肾通胶囊高剂量组与益肾通胶囊低剂量相比较无显著性差异(P＞0.05)。证明益肾通胶囊高、低剂量均能够降低大鼠前列腺组织Ki-67蛋白的表达,抑制前列腺细胞增殖、促进细胞凋亡。三结论1.本病虚实夹杂,本虚而标实,肾气虚衰是其根本原因,而血瘀是其主要的病理环节,并贯穿BPH发展的始终,故补益肾气,活血化瘀类中药在药物,在治疗日渐增多的BPH上,愈来愈显示了其重要作用。2.根据临床研究及以往试验研究结果,本课题的机理研究从细胞凋亡着手。益肾通胶囊对BPH的治疗作用是多环节、多靶点的,其能够降低前列腺湿重、体积、指数;能够改善前列腺组织病理增生性改变;能够调节前列腺组织bcl-2及bax表达平衡,促进前列腺细胞凋亡;能够降低前列腺组织Ki-67蛋白的表达,抑制前列腺细胞增殖。3.益肾通胶囊能够促进增生前列腺细胞凋亡,减少组织新生血管产生,降低细胞增殖活性,从而防止前列腺增生的发生,其作用机理可能是综合性的,是一种安全有效的中药品种,具有较大的应用前景。以上研究只是部分和初步的,有待今后进一步探讨。