鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV),为冠状病毒属一员,引起鸡的一种急性、高度接触性传染病。减毒苗常用于预防该病,但效果不理想且存在毒力返强的危险。为此,IB已成为养禽业最难控制的疫病之一。目前现有的IB基因工程疫苗虽可诱导机体产生一定的免疫保护效应,但与传统免疫相比,还存在一定的差距。增强IBV DNA疫苗的免疫效果对于预防IB的发生已显得尤为重要。为此,本研究扩增出IBV N基因和S1基因,对其序列进行了分析。在此基础上分别构建了N基因的原核表达质粒及真核表达质粒。诱导后重组菌的菌体蛋白与IBV阳性血清反应后,具有一定的抗原性。同时用减毒沙门氏菌作为运送真核表达质粒的载体,以商品鸡为动物模型,探讨其免疫特性。1.鸡传染性支气管炎病毒N基因和S1基因的克隆、序列分析及原核表达提取IBV C9001分离株RNA作为模板,根据GenBank登陆的相应S1基因和N基因序列设计特异性引物,其中,用于扩增S1基因的下游引物人为加入终止密码子。RT-PCR扩增后得到全长的N基因和S1基因。序列测定结果显示,所克隆的IBV C9001株N基因ORF全长为1230 bp,编码409个氨基酸;同源性比较结果表明,其与GenBank中有代表性的参考毒株N基因核苷酸和氨基酸序列有较高的同源性,在85.5%～99.8%之间。其中与Guangdong株、H52株、saib14株和saib wj株氨基酸序列同源性高达99.3%~99.8%,尤其以H52株同源性最高。所克隆的S1基因ORF全长1659 bp,编码552个氨基酸;同源性比较结果表明:与GenBank中有代表性的参考毒株S1基因核苷酸和氨基酸序列有较高的同源性,在71.5%～99.3%之间。纯化的PCR产物和pBV220质粒分别用EcoR I和SalⅠ酶切并回收。然后,将回收后的载体片段(pBV220)和目的片段(N)连接,构建重组原核表达质粒,限制性内切酶EcoR I、SalⅠ筛选和酶切分析阳性克隆。将pBV220-N重组大肠杆菌通过温度敏感诱导4h,其菌体裂解物经SDS-PAGE可检测到一条大小为46 kD左右的特异蛋白条带而含空质粒pBV220的大肠杆菌经诱导后未见目的蛋白表达。用IBV阳性血清对重组菌诱导后的全菌体蛋白进行Western-blotting检测,结果表明,诱导后重组菌的菌体蛋白与IBV阳性血清反应后,具有一定的抗原性。2.运送IBV N基因真核表达质粒的减毒沙门氏菌的构建及其在鸡体内诱导的免疫应答用限制性内切酶BamHⅠ、XhoⅠ将N基因从相应的重组质粒中切出,重组到真核表达载体pVAX1相应的酶切位点中,获得重组质粒pVAX1-N。以脂质体转染技术将重组质粒转染COS-7细胞,通过间接免疫荧光法进行表达产物检测,结果表明转染重组质粒的COS-7细胞有绿色荧光。这表明构建的重组真核表达质粒可在体外表达N蛋白抗原。通过电转化法将重组质粒pVAX1-N转入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207中,经PCR和沙门氏菌特异性血清凝集试验鉴定,获得重组菌SL7207(pVAX1-N)。将重组菌SL7207(pVAX1-N)分别以1×109 CFU、5×109 CFU、1×1010 CFU口服接种4日龄商品代伊莎褐蛋鸡,2周内所有试验鸡均无任何不良反应,试验结果初步表明重组菌SL7207(pVAX1-N)具有良好的安全性。首免35天,各试验组鸡体重在0.396 Kg-0.417 Kg之间,重组菌免疫组、灭活苗免疫组、H120免疫组与空白对照组之间没有显著性差异(P>0.05)。这说明重组菌免疫在一定程度上不影响鸡的生长。以5×109CFU剂量的重组菌SL7207(pVAX1-N)口服和滴鼻免疫4日龄商品鸡,免疫两次,间隔两周。在二免三周,用酶联免疫吸附试验(ELISA)分析重组菌免疫在鸡体内诱导免疫应答的情况。结果表明重组沙门氏菌具有良好的免疫原性,能分别诱导机体产生体液免疫应答和黏膜免疫应答。抗体测定结果表明,SL7207(pVAX1-N)免疫组血清抗体水平增加,与空白对照组、空载体对照组存在一定的差异,但不显著(P>0.05)。小肠黏膜抗体测定结果表明,SL7207(pVAX1-N)免疫组、H120免疫组均可以检测到针对N蛋白的特异性黏膜抗体。高于空载体对照组、空白对照组,但不存在显著性差异(P>0.05)。但部分个体的血清抗体和黏膜抗体水平与空载体对照组、空白对照组存在显著性差异(P<0.05)。