HIV-1毒株的耐药性是艾滋病抗病毒治疗的主要障碍,阐明耐药毒株的流行状况及分子进化规律,对于认识HIV耐药的机制、指导抗病毒治疗具有重要的意义。本研究首先对国内使用的in-house HIV基因型耐药性检测方法进行了评价,然后利用经过评价的in-house耐药检测方法对2009年河南省某地的艾滋病患者进行了耐药毒株流行状况的横断面研究,分析了耐药发生情况及对治疗的影响,为改进治疗方案提供依据。引入并改进了HIV准种的单基因组扩增法(Single-Genome Amplification,SGA),并用这种方法分析了一名接受蛋白酶抑制剂治疗的艾滋病患者体内印地那韦耐药准种的发生、发展过程,确定了新型印地那韦耐药突变模式。最后,根据在河南HIV耐药分子流行病学研究的结果,对筛选出来的与抗病毒治疗失败相关的新型突变位点进行了鉴定,通过构建突变病毒及表型耐药性研究,分析这些突变位点对耐药的作用。第一部分In-house HIV-1基因型耐药性检测方法的评价目的:评价国内建立并广泛使用的in-house HIV-1基因型耐药检测方法的准确性与敏感性。方法:以美国FDA批准的HIV-1基因型耐药性检测系统(ViroSeq? v2.0,雅培)为参比,两种方法平行检测130份艾滋病患者的血浆样本,比较二者在耐药突变位点检测以及耐药性解释方面的一致性。结果:两种方法均得到耐药结果的样本有110例。在已知的14850个HIV-1耐药突变位点中,两种方法可同时检出99.34%(14752/14850)的耐药突变位点(kappa值为0.9488,P值<0.00001)。在对不同类型的突变位点检测中,两种方法对蛋白酶抑制剂耐药突变位点、逆转录酶抑制剂耐药突变位点检测的一致率分别为99.70%和99.01%(kappa值分别为0.9099和0.9521,P值均<0.00001)。两种方法出具耐药检测报告结果的一致率为94.55%(kappa值为0.6374,P值<0.0001),表明两种方法在药物敏感性评价方面具有高度一致性。两种方法共检测到34个ViroSeq?数据库(ViroSeq?软件v2.7)未收录的位点,这些突变位点在SHDB数据库中对耐药性有一定影响。其中2个突变位点(逆转录酶区的V179F和K238T)对耐药的影响较大,提示in-house方法的数据库(SHDB)与ViroSeq?相比具有一定优势。结论:In-house基因型耐药性检测方法与ViroSeq?基因型耐药性检测系统在耐药突变位点检测以及药物敏感性评价上具有高度一致性,是一种快速准确、性价比高的HIV-1基因型耐药检测方法。第二部分河南省某地HIV-1耐药毒株流行状况的横断面研究目的:了解我国河南省某县艾滋病患者的抗逆转录病毒治疗的效果、免疫重建的情况和耐药性发生情况,为改进抗病毒治疗方案、提高疗效提供依据。方法:对某县120名2003年或2004年开始接受抗病毒治疗的艾滋病患者进行横断面研究。对每一名患者进行了面对面访谈,了解患者的临床表现、服药依从性等情况。经患者知情同意,采集10ml抗凝血。通过测定患者的病毒载量和CD4+T计数评价抗病毒治疗效果和免疫恢复情况,采用in house方法对治疗失败的患者进行了基因型耐药性检测。结果:120名艾滋病患者使用了三种抗病毒治疗方案,分别为AZT/DDI/NVP组(n=102);AZT/3TC/NVP组(n=12);D4T/3TC/NVP组(n=6)。患者的CD4+T细胞计数平均值为377±218 cells/ml,中位数为367 cells/ml,其中CD4+T细胞计数大于350 cells/ml的患者有64例(53.3%)。33例患者的HIV-1病毒载量小于检测限,其余患者病毒载量平均值为4.09±1.10 lg拷贝/毫升(中位数为3.87 lg拷贝/毫升)。在114例具有病毒载量数据的患者中,67例(58.77%)患者治疗失败(病毒载量大于1000拷贝/毫升)。经Fisher精确检验,三种治疗方案治疗效果之间没有显著性差异(P=0.53)。对治疗失败的患者(病毒载量大于1000拷贝/毫升)进行基因型耐药性检测,共67份标本,得到58份(86.6%)基因型耐药结果。其中40份产生了逆转录酶抑制剂耐药性,治疗失败患者中的耐药发生率为69.0%(40/58);蛋白酶抑制剂耐药发生率为0.0%(0/58)。治疗失败患者中核苷类逆转录酶抑制剂的耐药发生率为53.4%(31/58);非核苷类逆转录酶抑制剂耐药发生率为67.2%(39/58)。核苷类逆转录酶抑制剂中,AZT的耐药发生率最高(39.66%,23/58),非核苷类逆转录酶抑制剂中,NVP的耐药发生率最高(67.24%,39/58)。分析耐药患者的耐药水平,发现患者产生的耐药性基本上为中高度耐药,并且具有交叉耐药性。M41L、T215Y是耐药发生率最高的NRTIs类突变; K103N、Y181C是耐药发生率最高的NNRTIs类突变。结论:河南某县目前艾滋病患者的抗病毒治疗效果和免疫恢复均不理想,耐药毒株流行严重,目前的治疗方案已不适用,建议改变治疗方案,换用蛋白酶抑制剂。第三部分新型HIV-1耐药相关突变位点的鉴定由于HIV-1的流行毒株亚型不同、抗病毒治疗模式不同及长期的病毒/宿主/药物相互作用,新型HIV耐药相关突变位点不断被发现。逆转录酶是抗病毒药物最重要的靶点,已经鉴定了很多对药物敏感性影响非常大的突变位点,但这些突变位点主要位于具有催化活性的聚合酶区,连接区的耐药突变位点近几年才被发现。目的:鉴定前期研究筛选出来的新型逆转录酶基因突变位点对于耐药的作用。方法:利用定点突变和质粒转染技术,构建含有相关突变的HIV-1 pNL4.3病毒株。通过测定3种药物(AZT、EFV和NVP)对突变型和野生型病毒株对的50%抑制浓度(50% inhibitory concentration,IC50),确定突变位点对药物敏感性的影响。结果:成功构建7个突变病毒株,分别含有HIV-1逆转录酶基因的D123E、V292I、K366R、T369A、T369V、A371V和I375V突变。(1)A371V和T369V可使病毒对AZT的IC50分别增加3.60和2.83倍,其它5个突变却在一定程度上提高病毒对AZT的敏感性,特别是T369A,使病毒对AZT的IC50值降低35.67倍。(2)T369V和A371V可以导致EFV的低度耐药,IC50分别增加4.55和2.87倍数,其它5个突变可提高病毒对EFV的敏感性,特别是I375V,单独出现时可使病毒的IC50由8.11nM降低到1.23nM,降低了6.7倍。(3)突变T369V可导致病毒对NVP的耐药性,IC50增加11.55倍。其它突变对NVP耐药性的影响很小。结论:A371V可以导致低度AZT耐药(FC = 3.60),T369V分别可以导致EFV、NVP的低度和中度耐药(FC = 4.55,11.55)。首次证实HIV-1连接区的T369位点对AZT、EFV和NVP耐药性的影响均较大,T369A突变可提高病毒对AZT和EFV的敏感性,而T369V突变却导致对AZT、EFV和NVP的耐药性。第四部分单基因组扩增法分析HIV-1印地那韦耐药准种的分子进化HIV-1在感染者体内以准种形式存在,耐药毒株与野生毒株共存,在不同的药物压力下,呈动态的进化和发展过程。认识HIV-1耐药准种在体内的进化路径是阐明耐药机制的基础。目的:利用单基因组扩增法(Single-Genome Amplification,SGA)分析一名长期服用逆转录酶抑制剂、刚刚将奈韦拉平(Nevirapine,NVP)改为印地那韦(Indinavir,IDV)的艾滋病患者(XLF)体内IDV耐药准种的产生及发展情况。方法:对患者进行连续随访,采集6份系列血浆标本,包括服用IDV之前的1次样本(XLF1)和服用IDV之后的5次(XLF2至XLF6)样本。利用SGA法得到病毒聚合酶区(包括逆转录酶和蛋白酶全长)的准种序列,将得到的序列提交斯坦福大学HIV-1耐药数据库,得到耐药信息。结果:从6份系列样本中共得到了149条蛋白酶全长和171条逆转录酶全长序列,所有序列均为B亚型。患者服用IDV之前,病毒的蛋白酶区只含一些多态性突变位点。服用IDV之后,含蛋白酶区多态性位点的病毒比例下降,而含有次级突变位点G73S的病毒开始上升,并成为优势毒株。随着治疗时间延长,G73S与M46I/L90M组成一个连锁的耐药突变模式——M46I/G73S/L90M,并逐渐取代G73S成为优势毒株。在第6次随访的样本中,97.9%的病毒含有M46I/G73S/L90M突变模式。由于一直服用逆转录酶抑制剂,患者体内存在高比例的对逆转录酶抑制剂高度耐药的病毒株,并没有随着IDV耐药株的出现和发展产生大的变化。结论:引入并改进了SGA的方法,利用SGA方法确定了一种相对稀有的IDV耐药突变模式,即在突变G73S的基础上加入突变M46I和L90M,形成M46I/G73S/L90M突变模式。