【摘 要】
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研究背景及目的视网膜缺血再灌注损伤（Ischemiareperfusion injury,IRI）是眼科疾病常见的病理生理过程,多发生于急性闭角型青光眼（acute angle-closure glaucoma,AACG）、糖尿病视网膜病变（diabeticretinopathy,DR）、视网膜动静脉阻塞等疾病[1,2]。目前,视网膜IRI的确切机制仍不清楚,虽然有许多新方法和新技术应用于视网膜I
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研究背景及目的视网膜缺血再灌注损伤（Ischemiareperfusion injury,IRI）是眼科疾病常见的病理生理过程,多发生于急性闭角型青光眼（acute angle-closure glaucoma,AACG）、糖尿病视网膜病变（diabeticretinopathy,DR）、视网膜动静脉阻塞等疾病[1,2]。目前,视网膜IRI的确切机制仍不清楚,虽然有许多新方法和新技术应用于视网膜IRI相关疾病的诊治,但临床治疗效果欠佳,因此,寻找安全有效的减轻视网膜损伤的方法,具有重要的临床价值。研究证实,TOLL样受体（Toll-likereceptor,TLR）3介导的免疫调控是机体应对应激反应的第一道防线。越来越多的证据表明,TLR3介导的炎性和凋亡机制在心、肝、肺等脏器缺血再灌注（Ischemiareperfusion,I/R）损伤中发挥重要的作用,而细胞外 RNAs（Extracellular RNAs,exRNAs）包括双链 RNA（Double-stranded RNA,dsRNA）作为 TLR3 的内源性配体,通过激活 TLR3 信号通路调控I/R损伤的发生发展;同时,核糖核酸酶（Ribonuclease,RNase）作为exRNAs的水解酶,对I/R引起的脏器损伤有一定的保护作用。因此,本研究的目的是探讨exRNAs/TLR3介导的信号通路在视网膜IRI中的作用,以及RNase处理是否可以减轻视网膜IRI。方法选用C57BL/6J野生型（WT）小鼠和TLR3基因敲除小鼠建立视网膜I/R模型,采用RNA提取试剂盒提取血清总的RNA后用分光光度仪测定exRNAs的浓度;使用RNA选择性的绿色荧光标记技术检测组织中exRNAs的表达;RT-qPCR及Western-blot分别检测TLR3、胶质细胞纤维酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein,GFAP）、Caspase-3及炎性因子的表达;视网膜组织切片免疫荧光双标检测dsRNA/TLR3的表达;TUNEL法检测细胞凋亡;HE染色观察视网膜各层组织结构的变化。复苏原代Muller细胞后,进行Muller细胞传代培养和转染,用MTT法检测细胞活力,物理气箱法进行Muller细胞缺氧复氧（H/R）处理,收集Muller细胞后,免疫荧光双标检测dsRNA/TLR3的表达,免疫荧光单标法检测GFAP的表达,并采用RT-PCR方法检测Caspase-3及炎性因子的表达,TUNEL法检测Muller细胞凋亡情况。结果WT小鼠I/R后视网膜组织中TLR3和GFAP的表达水平明显增多,炎性因子表达增加,凋亡因子和TUNEL凋亡指数明显升高,视网膜损伤加重;给予TLR3抑制剂处理后,视网膜组织中TLR3和GFAP的表达水平明显减少,炎性因子表达下降,凋亡指数降低,视网膜损伤减轻;TLR3基因敲除显著的下调了视网膜组织中GFAP的表达,减少了炎性因子的生成,降低了凋亡指数,减轻了视网膜IRI。Muller细胞H/R后细胞中TLR3和GFAP的免疫荧光表达明显增多,炎性因子表达增加,TUNEL凋亡指数显著升高,细胞活力下降;抑制TLR3的表达后,显著的降低了 GFAP的免疫荧光表达水平,减少了炎性因子的生成,降低了TUNEL凋亡指数,提升了 Muller细胞的活力。WT小鼠I/R后视网膜组织中exRNAs及dsRNA的表达明显增多,给予RNase处理明显降低了 exRNAs及dsRNA的生成,下调了 TLR3和GFAP的免疫荧光表达,减轻了炎性因子的表达,减少了组织的凋亡,减轻了 I/R导致的视网膜损伤。结论TLR3介导的炎性机制和凋亡机制参与了视网膜IRI的病理生理改变,抑制TLR3表达或敲除TLR3基因均可显著的减轻视网膜IRI的发生。同时,研究发现增多的exRNAs包括dsRNA通过激活TLR3信号通路,促进了视网膜I/R导致的损伤,给予RNase处理可显著抑制机体的炎症反应和细胞凋亡,对视网膜IRI有一定的保护作用。
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