顺铂的发现开辟了癌症治疗的新领域,金属配合物药物也因此引起了人们的广泛关注并成为生物无机化学十分活跃的研究领域之一。人们用不同的金属离子和配体设计合成了各种各样的金属配合物并研究了它们的各种生物活性,如抗肿瘤,抗菌,抗疟疾和抗病毒等。然而,药物的毒副作用和耐药现象一直困扰着人们,因此,寻找高效低毒的金属药物是目前面临的一个重大挑战。铜,作为生物体内的必需元素,与非生命金属如铂、金相比具有较小的毒副作用,因此,铜配合物作为诊断和治疗疾病的潜在药物引起了人们极大的关注。最近的研究显示铜配合物可以通过抑制蛋白酶体的活性诱导癌细胞凋亡。随着蛋白质组学的发展,以蛋白质为靶标的具有选择性的低毒高效的靶向药物设计发展迅速,人们发现铜配合物能够抑制许多与重大疾病相关的蛋白质的活性,比如异柠檬酸裂合酶,拓扑异构酶I和II,脲酶和蛋白酪氨酸磷酸酶等。以上的研究结果使我们猜想生物体内可能存在一个铜配合物结合的蛋白质组能够与铜配合物强烈结合从而影响细胞的生理代谢。然而,它是如何与铜配合物相互作用并影响生理代谢的呢?是否能够筛选出选择性抑制某种或少数几种蛋白质活性的铜配合物?探究以上问题并能够取得一定的进展将对人们认识铜配合物的生理和药理作用,筛选与某种重要蛋白质特异性结合的低毒高效的铜配合物药物具有非常重要的理论意义和广阔的应用前景。本论文基于我们课题组提出的“铜配合物结合的蛋白质组学”的概念,旨在探究肝细胞中铜配合物结合的蛋白质组,筛选对某种蛋白质有一定的选择性抑制作用的铜配合物,为针对某种重要蛋白质的靶向药物设计和筛选低毒高效的铜配合物药物,揭示铜配合物的生理药理、药效和毒性提供理论依据和科学数据。主要研究成果如下:(1)用铜亲和层析柱和质谱分离和鉴定大鼠肝细胞中的铜结合的蛋白质,发现肝细胞中至少存在97种铜结合的蛋白质。通过阴(阳)离子交换柱纯化上述铜结合的蛋白质,得到五种丰度较高的铜结合的蛋白质,经质谱鉴定,分别是苹果酸脱氢酶(MDH),谷草转氨酶(AST),过氧化氢酶(CAT),钙网蛋白(CRT)和白蛋白(Alb)。(2)通过酶活性抑制实验和荧光光谱法研究了11种铜配合物与三种铜结合的蛋白质(AST,MDH和CAT)的相互作用。结果表明,单核席夫碱铜配合物对AST的抑制能力较强,对MDH和CAT的抑制能力较弱。在配合物1-11中,席夫碱铜配合物6对AST的抑制能力最强,IC50值为3.6μM。重要的是,细胞实验表明配合物6能够进入细胞并能够抑制细胞内AST的活性。这些结果表明,铜配合物的结构影响它们对不同酶的抑制能力和选择性,合理设计铜配合物的结构有利于筛选出针对某种铜结合的蛋白质抑制能力强,选择性高的铜配合物抑制剂。(3)以席夫碱为配体,设计合成了11种铜配合物并对其结构进行了充分表征,研究了这些配合物与五种铜结合的蛋白质(MDH,AST,CAT,PTP1B和TCPTP)的相互作用,发现铜配合物12,14,15对TCPTP有较强的抑制能力并表现出一定的选择性,铜配合物13选择性抑制PTP1B的活性。进一步研究了铜配合物12-15对细胞内PTP1B,TCPTP和AST活性的抑制情况。结果显示,铜配合物14和15强烈地增强了细胞内TCPTP底物的磷酸化水平,说明配合物14和15能够进入细胞并对细胞内TCPTP有较强的抑制能力,但二者对细胞内AST和PTP1B活性无明显影响,说明配合物14和15对细胞内TCPTP具有一定的选择性。这些结果表明,铜配合物和铜结合的蛋白质的结构共同影响其抑制活性和选择性,合理地修饰有机配体部分可实现筛选出针对某种酶抑制能力强,选择性高的铜配合物抑制剂。(4)设计合成13种其它金属(锌,钒,铽)配合物并对其进行了充分表征,研究了这些配合物与五种铜结合的蛋白质(MDH,AST,CAT,PTP1B和TCPTP)的相互作用。酶活性抑制实验表明,配合物23-35对MDH,AST和CAT几乎没有抑制能力,锌配合物23对TCPTP抑制能力较强且具有一定的选择性,而钒配合物31选择性抑制PTP1B的活性。蛋白免疫印迹实验表明,钒配合物31强烈地增强细胞内PTP1B底物的磷酸化水平,说明配合物31能够进入细胞并对细胞内PTP1B有较强的抑制能力。MTT比色法表明钒配合物31的毒性比VOSO4弱。以上实验结果表明,席夫碱锌配合物和氧钒配合物作为蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂比铜配合物可能具有更低的毒性,钒配合物31有望成为抗糖尿病药物开发的候选者之一。以上研究表明:生物体内的确存在能够与铜配合物相互作用并影响细胞生理代谢的铜配合物结合的蛋白质组。铜配合物结构不同,与不同的铜结合的蛋白质的结合能力和选择性就不同;配体相同的前提下,配位金属不同,与不同的铜结合的蛋白质的结合能力也不同;配合物和铜结合的蛋白质的结构共同影响二者的结合能力和选择性。