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血小板输注在临床上具有重要的应用价值,但血小板供需矛盾却日益明显。体外由干细胞制备巨核细胞及血小板有望解决血小板短缺的问题。脐带血中含有丰富的造血干细胞,可用于体外制备巨核细胞及血小板。目前,脐带血造血干细胞向巨核系细胞分化的数量及效率仍有待提高。我们基于巨核细胞特异基因PF4的报告系统的表达情况,从表观遗传调控小分子化合物库中筛选具有促进巨核细胞分化的小分子化合物,以提高造血干/祖细胞向巨核系细胞及血小板的分化效率和产量。方法:1、扩增人PF4基因启动子的DNA序列,与GFP序列连接并插入到PLVX-tight-puro载体上,构建重组质粒PLVX-PF4-promoter-GFP。将其包装慢病毒并感染人成巨核细胞白血病细胞MEG01和人红白血病细胞K562,通过流式细胞术检测GFP表达率,验证报告基因的转录活性。2、基于K562细胞,通过高内涵细胞成像技术对含有120个表观遗传相关小分子化合物库进行筛选,并对筛选出的小分子化合物在不同细胞系中进行验证。3、采用分阶段诱导的方式对CD34~+造血干/祖细胞进行诱导,在第二阶段加入Ricolinostat,作用7天后通过流式细胞术、集落形成实验等检测其对巨核祖细胞分化效率的影响。同时通过检测成熟巨核细胞表面标志和相关基因表达及产板能力,来验证第三阶段撤掉Ricolinostat后巨核细胞能否分化成熟。结果:构建了人PF4基因启动子报告载体并将其转入MEG01和K562细胞,基于PF4报告系统从120个小分子化合物库中筛选出能够增强PF4表达的小分子,确定Ricolinostat能够有效提高K562、MEG01中PF4的表达。通过分阶段诱导的方式以造血干/祖细胞为种子细胞诱导其向巨核细胞分化,并在诱导分化体系中加入筛选出的小分子化合物Ricolinostat,发现Ricolinostat对细胞总体增殖影响不显著,但可提高CD34~+CD41a~+细胞和CD41a~+CD61~+细胞比例和数量,进一步对巨核祖细胞进行分析,发现Ricolinostat显著提高CD34~+CD38~+CD45RA~-CD123~-CD41a~+巨核祖细胞的比例和数量;Ricolinostat处理后巨核祖细胞的集落形成能力显著提高,且巨核祖细胞相关转录因子表达显著升高。对诱导获得的巨核细胞进行生物学特征检测,结果显示Ricolinostat处理组和对照组诱导获得的巨核细胞均具有典型巨核细胞形态,且巨核细胞特异性细胞表面标志物,最终产生血小板也均具有粘附功能。结论:本研究通过高通量筛选获得增强巨核细胞特异性基因PF4表达的小分子化合物Ricolinostat,并证实Ricolinostat能够促进脐带血造血干/祖细胞向巨核祖细胞的定向分化,为进一步完善和优化造血干细胞向巨核细胞的诱导分化体系提供理论支持,并对未来巨核祖细胞的大规模体外培养扩增以及人工血小板的制备奠定了基础。